Этот протокол описывает быстрый и простой метод генерации первичных меланоцитов и фибробластов культур у мышей. Поскольку этот метод не требует, чтобы эпидермис и дерма разделены, он может быть выполнен быстро и последовательно с минимальной подготовки. Этот метод может быть использован для изучения каянозных меланоцитов и фибробластовой биологии.
Эксперименты в этих культурах могут дать представление о раке, заживлении ран и дефектах пигментации. Перед началом обязательно приготовьте все необходимые реагенты и проверьте температуру водяной ванны. Если вы планируете обработать несколько образцов, обратитесь к руководству по масштабированию реагентов в таблице 1.
Демонстрацией этой процедуры будет Брэндон Мерфи, аспирант из моей лаборатории. В шкафу ламинарного потока, кратко свернуть ствол каждой усыпанной мыши в стерильной чашке Петри, содержащей 70% этанола. Снимите мышь с этанола и поместите ее в пустую стерильную чашку Петри.
Далее стерилизовать хирургические ножницы в 70% этанола. Используйте эти ножницы, чтобы сделать разрез в коже на брюшной стороне туловища, начиная с шеи и продолжая хвост. Используя стерильные типсы, очистить кожу от ствола мыши, и удалить избыток жировой ткани из дермальной стороне кожи.
Поместите кожу, дермы стороной вниз, в шесть хорошо блюдо, содержащее три миллилитров 1X антибиотик антимикотического раствора. Инкубировать при комнатной температуре в течение двух-трех минут. Затем включите измельчитель тканей и отрегулируйте настройки к тем, которые показаны здесь.
Будьте уверены, проявлять осторожность при установке ткани измельчитель лезвия и при эксплуатации машины. Передача кожи, дермы стороне вниз, в стерильной ткани измельчитель блюдо и передать кожу полностью через ткань измельчитель в три раза. После этого перенесите гомогенизированную кожу в стерильную 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую три миллилитров буфера пищеварения кожи.
Используя микро-пипетки P1000, смешайте полученную подвеску, энергично промокая вверх и вниз 10-15 раз. Крышка конической трубки и инкубировать образец в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут, убедившись, что инвертировать трубку каждые три-пять минут. Далее, центрифуга трубки в размахивая ротор ведро при 750 раз G при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки в однородной коже.
Используйте микро-пипетку P1000, чтобы медленно и полностью удалить буфер пищеварения кожи, будучи осторожным, чтобы не беспокоить гранулы. Будьте уверены, чтобы аспирировать все буфера переваривания кожи. Если у вас возникли проблемы, мыть гранулы клеток с двух до трех мил меланоцитов средств массовой информации и повторить центрифугации и удалить избыток буфера переваривания кожи.
Затем тщательно повторно использовать клеточные гранулы в один миллилитр меланоцитов средств массовой информации путем трубопроводов вверх и вниз от 15 до 20 раз с P1000 пипетки. Передача в результате клеточного раствора падение мудрым, чтобы uncoated хорошо в шесть хорошо блюдо, которое содержит один миллилитр меланоцитов средств массовой информации. Инкубировать покрытием кожи гомогената в инкубаторе культуры тканей при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение 40 минут.
После этого перенесите культурную супернатанту из неокрашенного блюда в один колодец предварительно вымытого коллагена, покрытого шестью хорошо блюдом. Добавьте G-418 в средства массовой информации, так что окончательная концентрация составляет 100 нанограмм на миллилитр. Добавьте два миллилитров фибробластовых средств массовой информации в один колодец неокрашенного блюда, содержащего фибробласты.
Инкубировать обе культуры на ночь в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. После 16 до 24 часов инкубации, отдельно аспирировать средства массовой информации и любой мусор из каждой культуры. Вымойте каждое блюдо дважды, используя один миллилитр PBS для каждой стирки.
Затем добавьте два миллилитров свежих меланоцитов в культуру меланоцитов и добавьте два миллилитров свежих фибробластовых медиа в фибробластовую культуру. В этом исследовании фибробласты и меланоциты культур одновременно генерируются из одного и того же образца кожи. Когда гомогенизированная кожа впервые помылась, средства массовой информации появляются облачно.
Однако после инкубации в блюде становятся видимыми более крупные клеточные конгломераты и фибробласты клеток. Неприявляемые клетки культуры переносятся в блюдо с коллагеновым покрытием и обрабатываются G-418. Фибробласты, убитые G-418, плавают в среде культуры меланоцитов в течение следующих пяти дней.
После четырех-пяти дней в культуре, потроханые меланоциты начинают принимать дендритный фенотип с меланоцитарными гранулами. Этот фенотип сохраняется при пролете, в то время как кластеры загрязняющих кератиноцитов теряются. Чистота полученных меланоцитов и фибробластов подтверждается с помощью цитометрии потока.
Выражение меланоцитового маркера GP100 специфично для культур меланоцитов, в то время как фибробластный маркер, FSP1, находится исключительно в первичных фибробластах. Контроль C59 кератиноцитов клетки являются единственными культурами, которые пятно положительный для маркера кератиноцитов, K14. Проводятся дополнительные анализы для определения того, сколько времени требуется для установления обогащенных культур меланоцитов.
Положительные клетки GP100 начинают появляться на четвертый день и пик после 10 дней в культуре. Эта процедура может быть использована для быстрого генерации меланоцитов и фибробластов культур для различных в пробирке и высокой пропускной способности омических анализов.
