Эта работа была поддержана Национальным институтом де ла Здоровье и де ла Recherche MEDICALE, Национальный центр де ла Recherche Scientifique, Университет Страсбурга, Hôpital де Страсбург, Ассоциация по ла Recherche сюр ле Рак, Национальный институт дю Рак, Agence Nationale-де-ла Recherche и региона Эльзас. Пьетро LaNeve была поддержана Fondation Pour La Recherche MEDICALE. В настоящее время он является получателем Istituto Italiano Tecnologia (ИИТ) общения. Расходы на публикации поддерживаются сети Neurex (TriNeuron - Программа Interreg IV Рейн Верхний)

1 Сбор образцов <ol><li> Снять 2 клетки полу-приверженцем Шнайдера, (1-5 х 10 6 клеток в среднем), с помощью пипетки и собирать их с помощью центрифугирования (100 мкг в течение 1 мин). В случае, культивированных в пробирке адгезивных клеток, Trypsinize их в стандартных условиях или непосредственно собирают их из пластин в удобном количестве РНК извлечения реагента, по помощью клеточным скребком. </li><li> Для получения эмбрионов, растут линии дрозофил в лету клетках и пусть эмбрионы накапливаются на откладки яиц пластин. Протрите эмбрионов прочь кистью в дистиллированной воде (DH 2 O), отбросить мусор ситовым фильтрации, промыть и восстановить эмбрионов в пробирке 48. </li><li> В качестве альтернативного метода, вручную рассекают ткани / органы. Изолировать яички (преимущественное системы для анализа Пирны) из Drosophila живота в фосфатно-солевом буфере (PBS) при помощи стереомикроскопа (20-кратным увеличением), с помощью иглы или рассечение пинцет, как по отношениюualized в Sullivan и соавт 49. </li><li> Пестик гомогенизации образцы по наркомании 0,5 объемов добычи РНК реагента. </li></ol> 2 Экстракция РНК / Анализ <ol><li> Перечень поручений по итогам производителей выполнить изоляцию РНК через коммерческие реагентов. ВНИМАНИЕ! Выделения РНК агенты, как правило, токсичны и каустической. В качестве альтернативы, применить протеиназы К на основе протокола для изоляции 50 РНК, а именно: <ol><li> Развести образцы в 400 мкл стоп-Микс и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. </li><li> Восстановление водорастворимые компоненты от стандартной фенол: хлороформ: изоамиловый спирт и хлороформом и этанолом (этанола) осадков / мытья. Воздух сухой образцы и ресуспендируйте в диэтилпирокарбонатом (DEPC) -обработанной дважды дистиллированной (дд) H 2 O. </li></ol></li><li> Оценка концентрации РНК УФ спектрофотометрическим измерением. Также убедитесь, чистота РНК высока, близко к 2,0, басред на A 260/280 чтение. </li><li> Проверка препарат РНК на денатурирующих агарозном геле следующим образом: <ol><li> В чистом стакане, растворить 1,2 г агарозы в 82 мл DEPC-DDh 2 O, при непрерывном перемешивании. Варить до полного растворения. </li><li> Разрешить решение гель остыть; когда температура достигает 60 ° C добавляют 10 мл 10Х 4-morpholinepropanesulfonic кислоты (МОПС) буфер для 1X конечной концентрации (ФК), и 8 мл 37% формальдегида в 3% FC. ВНИМАНИЕ! Формальдегид является канцерогеном. </li><li> Налейте гель в горизонтальном электрофореза ячейки. Разрешить гель для отверждения под колпаком в течение по крайней мере 1 часа. После затвердевания, погрузите гель в MOPS 1X. </li><li> Алиготе 2 мкг образца РНК и 1 мкг Лествичник (использовать РНК маркер, когда правильная оценка желательно). Добавить 3 тома агарозном красителем (ALD) на РНК и лестницы. Нагревают при 70 ° С в течение 5 мин и сразу же охладили на льду. CAUTION! Содержание ALD (этидийбромид и формамидные см Материалы) являются мутагенным и коррозию, соответственно. </li><li> Загрузите образцы и запустить гель при 50 В в течение приблизительно 1 часа, периодически утилизации буфера. Проверьте РНК фракционирования шаблон УФ-визуализации или изображений гель. Признать дискретные полосы, соответствующие 28S и 18S рРНК и тРНК (рисунок 1). </li></ol></li><li> Перейдите к Северной Пробирной или магазина РНК при -80 ° С. </li></ol> 3 денатурирующих гель акриламида Подготовка <ol><li> Используйте маленькую вертикальную электрофоретическую аппарат для этого фракционирования стадии (размер пластины около 8 см х 9 см, гребень Толщина 0,75 мм). </li><li> Сборка чистые стаканы вместе в литейной рамы. </li><li> Подготовьте 10 мл 10% акриламида / бис-акриламида (19: 1) решение в MOPS 1X, 7 М мочевину. Сразу перед заливкой, добавить 100 мкл 10% персульфата аммония и 10 мкл TEMED и быстро перемешать раствор. ВНИМАНИЕ! Акриламид нейротоксичен и канцерогеном. </li><li> Вылейте гель между стеклянными пластинами и вставьте расческу также тщательно, чтобы избежать пузырей. Пусть гель полимеризации при комнатной температуре в течение по крайней мере 45 мин перед использованием. Кроме того, хранить гель O / N, завернутый в насыщенных водой фильтровальной бумаги и запечатаны в Саран обертывание. </li></ol> 4 Подготовка образцов <ol><li> Аликвоты 0,5-20 мкг общей РНК для каждого образца. Если объем превышает 3-4 мкл, вакуумная высушить образец. </li><li> Для определения размера, запускать аликвоту (20-30 сП) меченого низкого диапазона лестницы параллельно с образцами, в качестве маркера (смотри раздел 4.3 и 4.4 для подготовки). Treat его параллельно с образцами, как описано на стадии 4.5. </li><li> Лестница: настроить фосфата прямой реакции, используя 0,1 мкг на 10 б.п.-стремянки. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин, а остановить реакцию, добавив этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в 20 мМ FC. </li><li> Очищают этанола осадков / мытья, сухой воздух иресуспендируйте в DDh 2 O (около 100 мкл). ВНИМАНИЕ! 32 P является радиоактивный источник. </li><li> Для каждого образца добавляют равный объем акриламида синего красителя (ABD). Денатурируют нагреванием при 80 ° С в течение 5 мин и охладили на льду до погрузки. ОСТОРОЖНО! Формамид (содержание в ABD) вызывает коррозию. </li></ol> 5 Электрофоретическое Фракционирование <ol><li> Снимите стеклянные пластины из литья поддержки и правильно собрать их в электрофореза ячейки. Заполните как внутреннюю и внешнюю камеру с достаточной рабочим буфером (РБ). </li><li> Аккуратно удалите гребень и предварительно запустить гель при 200 V в течение 10 мин. Перед загрузки образцов, смыть отложения мочевины из колодцев, впрыскивая некоторое RB через шприц. </li><li> Используйте плоские советы, чтобы тщательно стратифицировать образцы шагом 4,5 в нижней части каждой скважины. Проверьте анодных и катодных соединения, чтобы избежать перевернутую работает. После того, как образцы проникать в гель при 100 V в течение 5 мин, яncrease напряжение до 200 В. </li><li> При длине фракционирования от около 7 см, 45 мин долгосрочной перспективе является достаточным. Избегайте бромфеноловый синий (отслеживание пигмента в ABD) переполнять гель. </li><li> Представьте на-гель фракционированных длинные РНК от этидийбромидом (EtBr) окрашивания, в качестве дополнительного шага: <ol><li> Обрежьте 2 см от верхней части геля и кратко промыть фрагмент в DDH 2 O. </li><li> Инкубируйте срез геля при комнатной температуре в течение 15 мин при осторожном shacking в РБ, EtBr 0,5 мкг / мл FC. </li><li> Destain геля в течение 15 мин в РБ, визуализировать длинные рРНК от УФ-облучения или изображений гель. Проверьте РНК погрузки и качества (см рис 1, панели 7). ВНИМАНИЕ! Бромид этиди является мутагенным. </li></ol></li><li> В то же время приступить блоттинга нижнюю часть геля, содержащего мелких видов РНК. </li></ol> 6 блоттинга <ol><li> Вырезать 6 кусков промокашки, чтобы соответствовать область блоттинга и эквивалентную часть unchargeд нейлоновую мембрану. Смочите листов бумаги, мембраны и 2 блоттинга колодки в РБ. Убедитесь, что полностью впитаться колодки, несколько раз сжимая их в РБ. </li><li> Удалить гель из аппарата и открыть стаканы на среднем помощью шпателя. Используйте чистую резак для удаления скважин. Поместите лист мокрой ватмане на геле и осторожно поднимите его. </li><li> Поместите нейлоновую мембрану на свободной поверхности геля. Отметить угол ориентировать фильтр в соответствии с нагружения образца. Заполните «сэндвич» (3 бумажные кусочки с каждой стороны). Рулон пластиковый стержень на поверхности блот, чтобы удалить любые возможные пузырьки воздуха. </li><li> Поместите кляксу между двумя блоттинга колодки и затем в фильтровальную кассету. Соберите кассету в промокательной модуля, заполнить камеру с РБ и проверить правильность ориентации (нейлоновую мембрану должны остаться между гелем и положительного конца). </li><li> Перевести на 20 V в течение 20 мин. Примечание: для обеспечения однородных условий, через 10 мин открыть промокательной модуль и гotate бутерброд на 180 ° до передачи. </li></ol> 7 Мембрана Сшивание <ol><li> Подготовьте 6 мл свежей сшивания решения (XLS). Пропитайте 10 см х 10 см (больше, чем нейлоновую мембрану) кусок промокательной бумаги с XLS. ВНИМАНИЕ! HCl (компонент XLS) отличается высокой агрессивностью. </li><li> Разберите кляксу и поместите мембрану на мокром 3 мм фильтровальной бумаги. Примечание: РНК, не должен быть в непосредственном контакте с насыщенным бумаги. Поместите фильтр и бумагу между двумя стеклянными пластинами и завернуть в Саран пленку. </li><li> Нагреть мембраны при 60 ° С в течение 2 ч, а затем в DDH 2 O стирки. Хранить при температуре -20 ° C или перейти к гибридизации. </li></ol> 8 Мембрана Предгибридизацию <ol><li> Если РНК погрузка была проверена (необязательный шаг 5.5), непосредственно перейти к гибридизации. Или же, срезать 1 см от до верхней части нейлоновый фильтр, чтобы избежать перекрестного зонда hybridizatioнс до фракционированных длинных РНК. </li><li> Разогреть 10 мл раствора гибридизации (HS) при 37 ° С. Денатурируют 1 мг спермы лосося при 95 ° С в течение 5 мин, охлаждают на льду и добавить к HS. </li><li> Инкубируйте фильтр в HS при 37oC в течение по крайней мере 1 ч, при вращении в гибридизации печи. Убедитесь, что РНК-часть фильтра обращена HS. </li></ol> 9 Probe Синтез <ol><li> Настройка прямой реакции фосфата на 10 пмоль антисмыслового олигонуклеотида определенной, как описано в 4.3. </li><li> Добавить 5 объемов Трис-ЭДТА-NaCl (десять) буфер для реакции и очистки меченого праймера от некорпорированных нуклеотидов с помощью гель-эксклюзионной хроматографии на колонках G-25 Sephadex (или также EtOH осадков). Зонд деятельность может быть оценена с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. </li></ol> 10. Мембрана Гибридизация <ol><li> Замените исчерпаны УГ со свежим 10 мл аликвоты (полученного и дополняется, как описано выше). Нагрейте датчик на95 ° С в течение 10 мин, охлаждают на льду и добавить к новым HS. Выдержите фильтр на 37 ° C ON. </li></ol> 11. Мембрана Стиральная <ol><li> Восстановление растворе для гибридизации и хранить его при температуре -20 ° С в радиоактивности-экранирования коробки. </li><li> Промойте фильтр в промывочным буфером (ВБ) и промойте его тщательно в течение 10 мин при комнатной температуре. </li><li> Используйте Гейгера Мюллера детектор для проверки остаточной радиоактивности в углах фильтров. Когда фон излучения составляет около 5 гц, приступить к мембранным экспозицию. </li></ol> 12. обнаружения сигнала <ol><li> Expose фильтр на авторадиографии фильмов или на молекулярном на экране тепловизора. Выявить сигналы от фотографической обработки или цифрового преобразования. </li><li> Анализ интенсивности полосы специального программного обеспечения количественного (ImageJ или OptiQuant). </li></ol> 13. Мембрана для зачистки <ol><li> Чтобы удалить первичные сигналы, погрузить мембраны в 500 мл кипящей десорбирующего раствора, А затем инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин. Перейдите к новой (предварительно) гибридизации и не храните фильтр при -20 ° С. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Хотя наша оценка из усложняем сплетающего через который РНК регулирует нейрогенез постоянно растет, механистические последствия РНК на основе электрических схем, затрагивающих нервную биологию стволовых клеток, дифференцировку нейронов / функциональной интеграции, развитие нервны?...

РНК биохимия пережил захватывающие прогрессирует в последние годы 1. Наша осмысление РНК потенциала в контроле экспрессии генов был лопнуть от идентификации мощных некодирующих рибо- регуляторов 2, в связи с открытием новых РНК на основе регуляторных механизмов 3,4 и более глубоким характеристик уже известных посттранскрипционных событий 5. Все вместе эти исследования позволили РНК биологии резко сделать сцену, став основным предметом исследования в современной научной ландшафта. В частности, за последние годы мы получаем ощущение всепроникающей влияния &quot;мира РНК&quot; на молекулярном нейробиологии 6, один из наиболее динамично развивающихся областей исследований в современной науке о жизни. В последнее десятилетие прошлого века, научная сценарий был революцию в связи с открытием в РНК-интерференция 7,8 и малых регуляторных РНК 9,10обращая особое внимание на микроРНК 11, эндогенно выразил небольшие некодирующих РНК участвует в контроле практически всех клеточных функций, как плейотропных и комбинаторных регуляторов экспрессии генов. Почти через 10 лет после микроРНК первоначального открытия в Caenorhabditis Элеганс по Ambros и лабораторий Ruvkun в, повышенное внимание было обращено к области, когда большое число микроРНК были выявлены у дрозофилы и в клетках человека, а 12-15. С тех пор, благодаря универсальным трансгенных подходов, Дрозофилы выдалась как ценный биологическом контексте для углубляясь в микроРНК биосинтеза и деятельности. Drosophila микроРНК выявили различные функции в насекомых-специфических или эволюционно консервативных процессов, охватывающих от старения для метаболизма, сигнальных путей , поведение и, конечно, нейрогенез. Наряду этом направлении, мы недавно представила новый ссылку 16 в интригующей сотрудничестваrrelation происходит между мастер гена г см / скольжения и РНК пути. Коэффициент муха транскрипции GCM / Glide 17-19 представляет собой уникальный пример клеточной судьбы определителя, который диктует глиальных против нейронов выбор судьбы в мультипотентных летать нейронных предшественников 20. Двадцать год исследования по этой теме явно подчеркнул возникновение многочисленных и дублирующих друг друга входам регуляции экспрессии генов сходящийся над ГКМ / скользить 21-28 установить пороговые уровни, необходимые для балансировки нежную соотношение между нейронными и глиальных коллегами во время развития нервной системы. Мы обнаружили, что регулирование с помощью DMEL-miR279 таргетинга представляет собой иной уровень управления, способствующий посттранскрипционных тонкой настройки гсм / скользить выражение 16. Во всем мире, эти направления исследований требуют от конкретные методологические усовершенствования: наряду лет, несколько технологий, первоначально разработанный для анализа традицitional РНК были преобразованы для количественного небольшие удобства РНК, кодирующие, вроде как анализов на защиту от РНКазы, кДНК массивов 29-31, ПЦР в реальном времени методов 32-35 и секвенирования 36,37. С другой стороны, калибровка технических подходов способствовала непрерывные прогрессирует в области. Нозерн-блот анализ (NB, или РНК гель-блот-анализ) представляет репрезентативную экземпляр: она в значительной степени используется для профилирования накопление РНК, так как он обеспечивает как уровень экспрессии количественного а также определение размера. Тем не менее, внутренняя бедных чувствительность метода ограничивает, когда он должен быть применен к низкой обильных экспрессии генов тонких тюнеров, как коротких РНК. Вредным следствием является требование больших количеств суммарной РНК, которая затрудняет его применение в конкретных биологических образцах. По этим причинам, конкретных вариантов NB для малого обнаружения РНК были разработаны 38-40: мы воспользовались улучшенным NB прокedure 41 (ENB, Enhanced Северная Клякса), в то время как выяснения вышеуказанное взаимодействие между DMEL-miR279 и г см / скольжения. Этот метод основан на шаге химической сшивки на основе активности производного карбодиимида [1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид, EDC], чтобы зафиксировать нуклеиновой кислоты на твердых подложках. Карбодиимида является универсальным сшивани, как известно, катализируют образование амидных связей между активированными карбоксильными или фосфатных групп и аминогрупп 42. Это свойство может быть использовано для ковалентно пару малых РНК с помощью их моно-фосфорилируются 5&#39;-гидроксильной группы до аминогрупп на поверхности нейлоновые мембраны. Полученную конфигурации крепления повышает доступность иммобилизованным нуклеиновой кислоты и, в свою очередь, эффективность гибридизации зонд-мишень, что приводит к повышению замечательной обнаружения 43. Методика предполагает особое relevancе в Drosophila молекулярных исследований, с помощью которых возникновение новых и отличительных классов малых РНК некодирующих становится 44. Среди них, rasiRNAs 45,46 составляют особую подтип Piwi взаимодействующих РНК (пиРНК 47), участвующих в последовательности конкретных молчания генов. Оперативные Детали этого метода полностью описаны и визуализировали далее, по отношению к анализу микроРНК DMEL-miR279 и DMEL-miR286 и, в первый раз, одного rasiRNA, rasi4. Мы толкнул до крайности этот метод, который позволил нам выявить плохо выраженные цели с минимальным количеством РНК (менее 1 мкг).

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

В последние десятилетия мы стали свидетелями взрыва научного интереса вокруг механизмов контроля экспрессии генов на уровне РНК. Эта отрасль молекулярной биологии была значительно подпитывается открытием некодирующих РНК в качестве основных игроков в пост-транскрипционной регуляции. Такая революционная перспектива сопровождается и вызвано развитием мощных технологий для профилирования короткий выражение РНК, как на уровне высокой пропускной (генома идентификации) или как одного кандидата анализа (стационарного накопления конкретных видов). Хотя несколько состояние дел в области стратегии в настоящее время доступны для дозирования или визуализации таких бегущих молекулы, Северная Клякса анализ остается право подход в молекулярной биологии для немедленного и точного вычисления выражения РНК. Она представляет первый шаг к применению более сложных, дорогостоящих технологий и, во многих случаях, остается льготный способ легко получить представлениев РНК биологии. Здесь мы обзору эффективный протокол (Enhanced Северная Клякса) для обнаружения слабо выраженные микроРНК (или других мелких нормативные вид РНК) из Дрозофилы целые эмбрионы, вручную расчлененный личинок / взрослых тканей или в пробирке культивируемых клетках. Очень ограниченное количество РНК не требуется, и использование материала, из проточной цитометрии-изолированные клетки могут быть также предусмотрены.

Следуя общую процедуру, описанную в тексте, а схематически представлено на рисунке 1, мы оценивали экспрессию малых РНК из сложных образцов РНК различного происхождения. В эксперименте, представленной на рисунке 1, РНК выделяли из 2 клеток дрозофилы Шнайдера по до...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Целью данной публикации является визуализация и обсудить оперативные шаги для улучшенного протокола Северная пятно на РНК, выделенной из Дрозофилы эмбрионов, клетки и ткани. Этот протокол является особенно полезным для эффективного обнаружения мелких видов РНК.

Улучшенная Северная Клякса обнаружения малых РНК видов в<em&gt; Дрозофилы</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Целью данной публикации является визуализация и обсудить оперативные шаги для улучшенного протокола Северная пятно на РНК, выделенной из Дрозофилы эмбрионов, клетки и ткани. Этот протокол является особенно полезным для эффективного обнаружения мелких...

Video: Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Препарирование Oenocytes от взрослых Дрозофилы</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Изоляция Дрозофилы Семенники

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Неинвазивный метод отбора проб волос для получения высоких ДНК Качество от Неуловимый мелких млекопитающих

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

Субстрат поколения для эндонуклеаз CRISPR / Cas системы

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Изображений Через куколки случае<em&gt; Дрозофилы</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Поддержание<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Население Кейдж

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...