Nous remercions Virginia Doherty et Junmei Yao pour l&#39;assistance technique. Cette recherche a été financée par NIMH (R01 MH084966), et le Bureau de recherche de l&#39;armée américaine et l&#39;Agence Defense Advanced Research Projects (accorder W911NF-10-1-0059) à KAG.

Toutes les expériences ont été effectuées en utilisant des rats mâles adultes Long-Evans. Toutes les procédures étaient en conformité avec les US National Institutes of Health (NIH) Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Institut de Technologie du Massachusetts et de la protection des animaux et l&#39;utilisation Bureau d&#39;examen des l&#39;USAMRMC. 1. Préparation <ol><li> Heparinise le cathéter et la seringue de l&#39;aiguille en plaçant un blindage contenant de l&#39;héparine dans 500 ul de tube (USP 1000 unités / ml) et ensuite aspirer et expulser la solution d&#39;héparine à travers l&#39;aiguille. <ol><li> Fixez un cathéter papillon à la seringue. Gardez le bouclier sur l&#39;aiguille du cathéter pour protéger la pointe acérée de dommages. </li><li> Prélever un volume de l&#39;héparine qui est légèrement supérieur au volume de sang qui seront recueillies. Détachez la seringue et remplissez-le avec de l&#39;air. </li><li> Re-fixer la seringue au cathéter et utiliser leair pour expulser l&#39;excès de solution d&#39;héparine; assurer que des traces restent dans le tube, aiguille et la seringue. </li><li> Placez le cathéter stérile, avec la seringue encore attachée, sur une surface stérile. </li></ol></li><li> Sécuriser rapidement le rat dans un chiffon propre veiller à ce que antérieurs et pattes arrière sont dans une position confortable et la respiration est sans restriction. <ol><li> Fixez l&#39;enveloppe avec crochet et la bande de boucle; veiller à ce que les organes génitaux externes ne sont pas étranglés. </li><li> Avoir un assistant doucement et retenir fermement le rat (abdomen et la base de la queue) sur une surface de travail solide avec la queue pendait au bord du comptoir. </li></ol></li></ol> 2. L&#39;échantillonnage de sang <ol><li> Plonger la queue dans l&#39;eau C 42 ° pour 40-50 sec à dilater les vaisseaux sanguins et sécher la queue avec une serviette en papier. Localisez la veine de la queue d&#39;être saigné (tourner tout le corps avec la queue pour empêcher la torsion de la queue). Remarque: le réchauffement suffisant de la queue est critique pour la collectio rapiden d&#39;un échantillon de sang. Si le système vasculaire est resserré, le positionnement correct du cathéter est difficile, et la circulation sanguine est nettement réduite. Un coussin chauffant peut être utilisé comme une alternative à l&#39;immersion dans l&#39;eau. </li><li> Identifier le point d&#39;échantillonnage. Remarque: L&#39;artère se trouve le long de l&#39;aspect mi-dorsale de la queue; ne pas utiliser ce pour l&#39;échantillonnage. <ol><li> Cible soit les veines de la queue de gauche et de droite qui se trouvent latéralement à l&#39;artère. La pigmentation de la queue, qui varie selon la souche et augmente avec l&#39;âge, peut occulter une partie de la vascularisation. Cible une partie de la veine dans la partie inférieure de la queue. </li><li> Essuyez la zone cible avec une solution antiseptique de chlorhexidine 2%. </li></ol></li><li> Créer une pression négative dans la seringue et le cathéter en retirant le piston de zéro à environ 50 ul. </li><li> Tenez la queue avec douceur et fermeté près de la pointe de garder la queue droite long de la collecte de l&#39;échantillon. Assurez-vous que le flux sanguin est pas fermé par une poignée trop serré.</li><li> Insérez lentement le cathéter dans la veine à un angle faible d&#39;environ 5 cm de la pointe de la queue. Lorsque la veine est pénétré, le sang va couler dans le cathéter. Retirer lentement le piston de la seringue pour recueillir le volume souhaité à un rythme soutenu (~ 20 pi par seconde). <ol><li> Consultez le personnel vétérinaire pour des informations sur le volume maximum de sang qui peuvent être recueillis. La quantité maximale de sang qui doit être recueillie dépend de l&#39;état de santé et du poids du rat. Ne pas retirer plus de 15% du volume sanguin total dans une période de 14 jours. Remarque: Le sang est beaucoup plus difficile de recueillir des animaux qui ont été vivement soulignée dans les minutes avant le prélèvement des échantillons parce que les hormones de stress contractent le système vasculaire. Par exemple, le déménagement de la cage du rat à une nouvelle chambre, en prenant plusieurs minutes pour conclure l&#39;animal, ou l&#39;insertion répétée du cathéter dans une veine sont tous susceptibles de déclencher une réaction de stress aigu. </li><li> Faciliter blood écoulement par «traite» la veine. Exécuter un doigt le long de la longueur de la veine, de la base vers l&#39;extrémité de la queue, mais restent plus de 2 cm de la pointe de l&#39;aiguille insérée ou le cathéter peut se détacher de la veine. </li><li> Si le sang ne peut pas être collecté avec succès à partir du site initial de pénétration du cathéter, ré-insérer l&#39;aiguille plus haut dans la veine. Si le sang a été prélevé sur le site initial, re-pressuriser l&#39;aiguille en débranchant puis en rebranchant le cathéter et la seringue avant la ré-insertion dans la veine. En général, éviter les pénétrations supplémentaires. </li><li> Comme pénétrations multiples peuvent provoquer l&#39;effondrement veine de la queue, dans lequel l&#39;approvisionnement en sang à la queue est coupée et le tissu de queue molle devient nécrosée, euthanasier le rat si il ya veine de la queue effondrement. </li></ol></li><li> Lorsque le volume d&#39;échantillon suffisant est collecté, relâcher la pression dans la seringue en débranchant et en rebranchant le cathéter. Aspirer légèrement à l&#39;aide du piston de la seringue (~ 50 &amp; #181; l), et de retirer l&#39;aiguille de la veine. Remarque: Si l&#39;aiguille est retirée sans relâcher d&#39;abord la pression dans la seringue, le sang va couler de l&#39;aiguille. </li><li> Appliquer brièvement une pression sur le site d&#39;insertion pour arrêter le saignement, et essuyez la zone avec une solution antiseptique. Retour le rat à sa cage. </li></ol> 3. traitement de l&#39;échantillon de sang <ol><li> Aspirer l&#39;air pour assurer le sang ne reste à l&#39;intérieur de l&#39;aiguille du cathéter, et utiliser des ciseaux pour couper le tube du cathéter juste au-dessus de l&#39;aiguille. Expulser le sang dans un tube de 1,5 ml à centrifuger stérile. Remarque: Si le sang est poussé à travers l&#39;aiguille, la force de cisaillement peut entraîner des globules rouges à la rupture qui peut interférer avec de nombreux essais en aval. Retirez l&#39;aiguille pour éviter l&#39;hémolyse. <ol><li> Pour récupérer le plasma sanguin, les tubes contenant de l&#39;EDTA utilisation comme anticoagulant (ici, en utilisant 10 ul d&#39;EDTA 0,1 M de 200 à 400 pi de sang; assurer la concentration de l&#39;EDTA utilisé ne pas interférer avecvec le dosage en aval) et placer sur la glace. <ol><li> Spin échantillons de sang total à 2100 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) pendant 10 min à moins de 10 min de la collecte. Éluer le plasma, ce qui évite de perturber les couches de globules rouges et blancs. </li></ol></li><li> Pour collecter le sérum sanguin, placer les échantillons (sans anticoagulant) à la température ambiante pendant 30 min pour permettre la coagulation. Faites tourner les tubes de prélèvement dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) à 2000 x g. Le sérum peut ensuite être élue. </li></ol></li><li> Utiliser des échantillons immédiatement ou conserver à -80 ° C pendant jusqu&#39;à un an. </li></ol>

<ol>
	<li>Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNAs+in+Patients+with+Acute+Myocardial+Infarction.">Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction.</a> Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).</li><li>Shah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Polyps:+Systematic+Review.">Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).</li><li>Chan, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+blood-based+protein+biomarker+strategies+in+the+study+of+psychiatric+disorders.">Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders.</a> Prog Neurobiol. , (2014).</li><li>Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+induces+learning+impairment+that+is+mediated+by+interleukin+1beta+in+rodents.">Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents.</a> PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).</li><li>Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+impairment+of+acquisition+of+a+spatial+memory+task+following+isoflurane-nitrous+oxide+anesthesia+in+rats.">Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats.</a> Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).</li><li>Vahl, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+ACTH+and+corticosterone+sampling+methods+in+rats.">Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).</li><li>Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+rats+with+various+behavioral+characteristics+during+acute+emotional+stress.">Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress.</a> Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).</li><li>McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+stress+hormones+in+health+and+disease:+Understanding+the+protective+and+damaging+effects+of+stress+and+stress+mediators.">Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators.</a> Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).</li><li>Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+norepinephrine+and+epinephrine+concentrations+in+adrenal+gland+of+the+rats+submitted+to+acute+immobilization+stress.">Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress.</a> Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).</li><li>Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ghrelin-growth+hormone+axis+drives+stress-induced+vulnerability+to+enhanced+fear.">A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear.</a> Mol Psychiatry. , (2013).</li><li>Knoll, A. T., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynorphin,+stress,+and+depression.">Dynorphin, stress, and depression.</a> Brain Res. 1314 (56-73), (2010).</li><li>Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical/hippocampal+monoamines,+HPA-axis+changes+and+aversive+behavior+following+stress+and+restress+in+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder.">Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder.</a> Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ici, nous décrivons un procédé simple et rapide pour l&#39;obtention d&#39;un échantillon de sang d&#39;un rat qui offre des avantages significatifs par rapport à d&#39;autres techniques couramment utilisées. En premier lieu, il ne nécessite pas d&#39;anesthésie, en contraste avec l&#39;échantillonnage à partir de la veine jugulaire ou sinus rétro-orbital. Lorsque les échantillons de sang sont collectés entourant les procédures de comportement, l&#39;administration d&#39;anesthésiques est indésirable car il peut interférer avec l&#39;apprentissage et de la mémoire 4,5. Deuxièmement, il offre la possibilité de collecter des volumes de sang plus importantes que d&#39;autres techniques de ponction veineuse, comme la collecte des veines saphènes de pédale ou dorsales. En utilisant la technique décrite ici, jusqu&#39;à 1,5 ml de sang peut être recueilli à partir d&#39;un rat à un seul point du temps, un volume qui permet facilement de multiples dosages pour être exécutés en parallèle. Enfin, cette procédure minimise le risque d&#39;endommagement du tissu par rapport à bout de la queue amputation ou de saignement rétro-orbital. L&#39;utilisation de cette procédure facilite le respect de l&#39;animal WLoi Bien-être social et le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, ce qui nécessite de minimiser la douleur et la détresse qui résultent de procédures de laboratoire effectués sur les animaux. Il est recommandé que les enquêteurs nouvelles à cette méthode en pratique les techniques de contention et la queue saignement afin de minimiser le temps que les animaux expérimentaux sont retenus. Le sang prélevé en moins de 3 min à partir du début de la retenue fournit des résultats optimaux. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour l&#39;échantillonnage de 1 à 4 fois par semaine, mais pas plus de deux fois par jour. Si les collections sanguines répétées peuvent être réalisées, différents sites d&#39;échantillonnage en mouvement vers le haut à partir de la base de la queue doivent être utilisés, et les veines de la queue gauche et droite doivent être alternés comme sites d&#39;échantillonnage. Le volume total de sang de rongeurs est 6-7% de leur poids corporel, et pas plus de 15% du volume total de sang doit être collecté sur une période de deux semaines. Sérumou plasma comprend environ 40-60% du volume d&#39;échantillon prélevé. Prise de sang à travers les veines de queue latérales peut également être réalisée chez la souris, comme décrit ici, avec quelques modifications mineures. Tout d&#39;abord, seul petit calibre (27 G) Les cathéters peuvent être utilisés. Deuxièmement, il est recommandé d&#39;utiliser un dispositif de retenue du tube, plutôt que d&#39;une enveloppe, pour immobiliser les souris. Le volume de sang qui peut être obtenu à partir de la souris à l&#39;aide de la ponction veineuse faisceau vasculaire sous-maxillaire (200-500 ul) est plus grande que ce qui peut être collecté en toute sécurité à partir de la veine de la queue (200 ul maximum). Parce que l&#39;échantillonnage du sang du faisceau vasculaire sous-maxillaire nécessite confinement minimal et peut produire plus de sang, ceci est la voie préférée pour le prélèvement chez la souris. La rapidité avec laquelle cette procédure peut être effectuée, avec sa nature peu invasive, minimise également la perturbation potentielle de mesures à base de sang par la réponse de stress aigu 6. Leréponse de stress aigu peut modifier les taux circulants de nombreuses molécules, y compris les interleukines et d&#39;autres facteurs immunitaires actif 7, les hormones de l&#39;axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien 8, hormones dans le système nerveux sympathique 9, la ghréline 10, les opioïdes endogènes 11, la dopamine, et sérotonine 12. Si repos circulant mesures de ces molécules ou d&#39;autres réglementés par ces molécules sont souhaitées, il est important de minimiser la réponse au stress, qui est déclenché dans aussi peu que d&#39;une minute du début de l&#39;exposition de stress. réponses de stress non seulement modifient la composition du sang, mais représentent également un obstacle technique pour l&#39;échantillonnage de sang à cause de la constriction des vaisseaux via augmenté dur du système nerveux sympathique. Il devient de plus en plus difficile d&#39;obtenir le flux sanguin régulier d&#39;un rat qui est le montage d&#39;un état de stress aigu. Par conséquent, la détresse de l&#39;animal doit être minimeized afin d&#39;obtenir rapidement des échantillons qui reflètent l&#39;état physiologique d&#39;intérêt.

Biomarqueurs obtenus à partir de sang fournissent diagnostic utile, prédictive et stratification des mesures dans de nombreux contextes cliniques, y compris les maladies cardiovasculaires 1, les sciences de cancer 2, et la maladie psychiatrique 3. Ils peuvent également être utilisés dans la science fondamentale pour évaluer «l&#39;état» de l&#39;organisme, y compris le degré de la faim, de l&#39;inflammation, ou le stress présent. De telles mesures peuvent être influencées par les variables qui peuvent ou peuvent ne pas être critique pour la question de l&#39;intérêt, y compris le moment de la journée que l&#39;échantillon est obtenu et le sexe des sujets. Il peut également être influencée par la contrainte induite pendant les procédures d&#39;échantillonnage de sang lui-même. Les hormones du stress et de la perception de la douleur peuvent modifier rapidement la composition du sang. Les rongeurs sont des animaux de laboratoire le plus couramment utilisé, et plusieurs méthodes ont été développées pour la collecte de sang. La méthode idéale de prélèvement de sang doit avoir un minimum de Physiological impact sur l&#39;animal, ne nécessitent pas d&#39;anesthésie, permet l&#39;échantillonnage rapide et répétée, et de fournir le volume de sang suffisante pour de nombreuses applications en aval. Techniques populaires pour la collecte de sang tels que le cathétérisme de la veine jugulaire ou bout de la queue amputation ne répondent pas à ces critères. Le but de ce protocole est de décrire une technique de prélèvement de sang destiné à être utilisé chez les rats qui est minimalement stressant, ne nécessite pas d&#39;anesthésie, permet de multiples collectes de sang au sein d&#39;un seul sujet et fournit un volume d&#39;échantillon relativement grand de telle sorte que de multiples dosages peuvent être réalisés sur un seul échantillon. L&#39;objectif de cette méthode est d&#39;obtenir des échantillons de sang qui sont peu influencés par la réponse de stress aigu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium heparin (1000 USP units/ml)</td>
			<td>Patternson Veterinary Supply</td>
			<td>25021040010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>JT Taylor</td>
			<td>JT2020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermachlor Rinse-Chlorhexadine</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>6356</td>
			<td>Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>TESV25BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin 1cc syringes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BD309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89202-682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#956;l microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>21150-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, stainless steel, 5&#34;</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml plastic beaker</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>414004-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean cloth wrap</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Velcro tape, .75&#34; width</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>B004AF9II6</td>
			<td>Hook and loop tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling blood from the lateral tail vein of the rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Le plasma sanguin ont été recueillies à partir de la veine caudale latérale comme décrit dans le protocole donne un échantillon de plasma qui est translucide de couleur jaune pâle et d&#39;aspect. Comme le montre la Figure 1, l&#39;hémolyse dans un échantillon donne une teinte rouge au plasma. La réponse de stress aigu peut modifier rapidement la composition du sang. Par exemple, circulant concentration de corticostérone peut nettement augmenter à moins de 10 min de l&#39;exposition au facteur de stress, comme représenté sur la Figure 2. Les faibles niveaux de base de la corticostérone obtenus avec ce procédé antérieur de facteur de stress exposition révèlent que la procédure d&#39;échantillonnage lui-même constitue pas une source importante de stress. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig1.jpg" /> Figure 1:. Apparence échantillon (A) Un échantillon hémolysé est affiché. Après centrifugation, le plasma ou le sérum couche (indiquée par la surface ar noirrangée) apparaît teintée de rose ou rouge. Teintes sombres indiquent des niveaux plus élevés d&#39;hémolyse. (B) Après centrifugation, un échantillon correctement collecté aura un aspect jaunâtre clair pour la bande supérieure (de surface indiquée par la flèche noire), qui correspond au plasma non-hémolyse ou de sérum. Lors du retrait de cette couche, il est important de ne pas perturber le sang total sous-jacent, soit en poussant la pointe de la pipette dans l&#39;ensemble de la couche de sang ou en aspirant une partie du sang entier dans la pointe. Toute plasma ou le sérum contaminé avec du sang total doivent être jetés. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig2.jpg" /> Figure 2: la corticostérone plasmatique est rapidement élevée suite à une expérience stressante Du sang a été obtenu à partir de la veine caudale latérale de rats femelles adultes Long-Evans avant et 10 min après l&#39;exposition à quatre tons (10 sec, 2 kHz, 85 dB) co-terminaison. avec footshocks (1 sec, 350 uA). corticostérone de plasma sanguin au départ (290,4 ± 138,8 pg / ml) était significativement inférieurs aux niveaux observés 10 min après la présentation de la contrainte de choc électrique (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), tel que déterminé par t apparié -test. *, P &lt;0,05

Watch this Scientific Journal Video about Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat at JoVE.com

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

L&#39;échantillonnage de sang de la veine caudale latérale de la Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

sampling-blood-from-the-lateral-tail-vein-of-the-rat

Research

JoVE Journal

Biology

102.1K vues.  Massachusetts Institute of Technology. Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Vidéo: Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

Dessin de sang de rats à travers la veine saphène et par ponction cardiaque

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Recherche

Biologie

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection du cerveau de rat pour l&#39;ARN ou de l&#39;extraction de protéines à partir région spécifique du cerveau

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Enrichissement des cellules NK du sang humain avec le Kit de RosetteSep StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Collecte de sang du crabe américaine Horseshoe, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Préparation des tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Non-Terminal techniques d&#39;échantillonnage de sang chez les cobayes

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for detecting the successful establishment of blood chimerism in parabionts by a caudal vein injection of glucose. Parabiotic mice were constructed. Glucose was injected into the donor mouse through the tail vein, and the fluctuation of blood glucose level was measured in both mice using a blood glucometer at different time points. Our results showed that after glucose injection, the blood glucose level in donor mice increased sharply after 1 min and decreased slowly thereafter. Meanwhile, the blood glucose level of the recipient mice peaked 15 min after injection. Similar results were obtained with Evans blue, used as a positive control for glucose. The synchronous fluctuation of blood glucose levels indicates that blood flow between the two mice was established successfully.

Here we describe a new method of detecting successful establishment of shared blood circulation of two parabionts through a caudal vein injection of glucose, which causes minimal damage and is not fatal to the parabionts.

Détection de l’établissement de l’approvisionnement en sang partagé dans les souris parabiotiques par injection de glucose de veine caudale

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...