우리는 기술 지원을 버지니아 도허티와 Junmei 야오 감사합니다. 이 연구는 NIMH (R01 MH084966), 미국 육군 연구 사무실 및 방위 고등 연구 기관에 의해 투자되었다 KAG에 (W911NF-10-1-0059을 부여).

모든 실험은 성인 남성 긴 에반스 쥐를 사용하여 수행 하였다. 모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 (NIH) 가이드의 미국 국립 연구소에 따라했고, 매사 추세 츠 공과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 동물 관리 및 사용 검토 사무소에 의해 승인되었다 USAMRMC. 1. 준비 <ol><li> 바늘을 통해 헤파린 용액 (1000 USP 단위 / ㎖) 500 ㎕를 함유하는 튜브로 헤파린 차폐 바늘을 배치하고 흡입 및 배출하기로 카테터를 주사기 Heparinise. <ol><li> 주사기에 나비 카테터를 연결합니다. 손상으로부터 날카로운 팁을 보호하기 위해 카테터의 니들 위에 실드를 유지. </li><li> 수집 될 혈액의 부피보다 약간 큰, 헤파린의 양을 철회. 주사기를 분리하고 공기를 채운다. </li><li> 다시 부착 카테터에 주사기와를 사용공기 과잉 헤파린 솔루션을 추방하기 위해; 단지 양이 튜브, 바늘과 주사기에 남아 추적 확인합니다. </li><li> 멸균 표면에 여전히 부착 된 주사기, 멸균 카테터를 놓습니다. </li></ol></li><li> 빨리 ...의 앞에와 hindpaws 편안한 위치에 호흡이 제한되지 보장 깨끗한 천에 쥐를 고정합니다. <ol><li> 후크 및 루프 테이프로 랩을 고정; 외부 성기가 수축되지 않도록. </li><li> 부드럽게 보조를하고 단단히 꼬리가 카운터의 가장자리에 걸려와 고체 작업 표면에 쥐 (복부와 꼬리의 기반을) 억제. </li></ol></li></ol> 2. 혈액 샘플링 <ol><li> 혈관을 팽창하고 종이 타월로 꼬리를 건조 40 ~ 50 초 동안 42 ° C의 물에 꼬리를 담근다. (꼬리를 왜곡 방지하기 위해 꼬리와 몸 전체를 회전) 출혈되는 꼬리 정맥을 찾습니다. 주 : 꼬리의 충분한 온난화는 빠른 collectio 중요하다혈액 샘플의 N. 혈관 수축 한 경우 카테터의 적절한 배치가 어렵고, 혈액의 흐름은 크게 감소된다. 가열 패드 침수에 대한 대안으로 사용될 수있다. </li><li> 샘플링 포인트를 확인합니다. 참고 : 동맥 꼬리의 중간 등의 측면을 따라 자리 잡고 있습니다; 샘플링이 사용하지 마십시오. <ol><li> 동맥 측면 거짓말을 왼쪽과 오른쪽 꼬리 정맥를 대상입니다. 변형에 따라 다릅니다과 나이에 따라 증가 꼬리의 색소 침착은 혈관의 일부를 가릴 수 있습니다. 꼬리의 하부에 정맥의 부분을 타겟팅. </li><li> 2 % 클로르헥시딘 소독액으로 목표 부위를 닦아주십시오. </li></ol></li><li> 약 50 μL에 0에서 플런저를 철수하여 주사기와 카테터에 음압을 만듭니다. </li><li> 바로 샘플 수집을 통해 꼬리를 유지하기 위해 팁 근처에 부드럽게 단단히 꼬리를 잡으십시오. 혈액의 흐름이 지나치게 꽉 그립에 의해 폐색되지 않았는지 확인합니다.</li><li> 천천히 약 5cm 꼬리의 끝에서 얕은 각도로 정맥에 카테터를 삽입합니다. 정맥이 관통 될 때, 혈액은 카테터 내로 흐를 것이다. 천천히 (~ 초 당 20 μL)을 일정한 속도로 원하는 양을 수집하기 위해 주사기의 플런저를 철회. <ol><li> 수집 할 수있는 최대 혈액량에 대한 자세한 내용은 수의학 직원에게 문의하십시오. 수집해야 혈액의 최대 금액은 쥐의 체중과 건강 상태에 따라 달라집니다. 14 일의 기간에 총 혈액량의 15 % 이상을 인출하지 마십시오. 참고 : 혈액은 급성 스트레스 호르몬은 혈관을 수축하기 때문에 수집을 샘플링하기 전에 분 안에 강조했다 동물로부터 수집하는 것이 훨씬 더 어렵다. 예를 들어, 정맥에 동물, 또는 카테터의 반복 삽입을 포장하는 데 몇 분 정도 복용, 새로운 방에 쥐의 홈 케이지를 이동하는 모든 급성 스트레스 반응을 일으킬 가능성이 있습니다. </li><li> (B100)를 촉진&#39;착유&#39;정맥으로 D 흐름. 꼬리의 끝을 향해베이스로부터, 혈관의 길이를 따라 손가락을 실행할 수 있지만 정맥으로부터 빠질 될 수 삽입 바늘 또는 카테터의 선단으로부터 2 cm 이상 남아있다. </li><li> 혈액이 성공적 카테터 침투의 초기 위치로부터 수집 될 수없는 경우, 정맥까지 상기 바늘을 다시 삽입. 혈액 초기 사이트에서 수집 된 경우, 분리 한 다음 정맥에 삽입을 다시하기 전에 카테터와 주사기를 다시 연결하여 바늘을 다시-가압. 일반적으로, 추가 관통을 피하십시오. </li><li> 다수의 관통은 꼬리 혈액 공급을 차단하고 부드러운 꼬리 조직이 괴사로되는 꼬리 정맥 붕괴를 야기 할 수있는 바와 같이 꼬리 정맥 붕괴가있는 경우, 래트를 안락사. </li></ol></li><li> 적절한 샘플 볼륨이 수집되면, 분리 및 카테터를 다시 연결하여 주사기에 압력을 놓습니다. 대기음 약간 주사기 플런저를 사용하여 (~ 50 #181; L), 및 정맥 주사 바늘을 철수. 주 : 바늘 주사기 제 내의 압력을 방출하지 않고 회수되는 경우, 혈액이 바늘에서 떨어지지 것이다. </li><li> 간단히 지혈 및 살균 용액으로 영역을 닦아 삽입 부위에 압력을 적용합니다. 홈 케이지에 쥐를 돌려줍니다. </li></ol> 3. 혈액 샘플을 처리 <ol><li> 대기음 공기에는 혈액이 카테터를 바늘 내부에 남아 있지 확인하고 바로 바늘 위의 카테터 튜브를 잘라 가위를 사용합니다. 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 혈액을 추방. 주 : 혈액이 바늘을 통해 밀면 전단력 많은 하류 분석을 방해 할 수있는 파열 적혈구를 일으킬 수있다. 용혈을 방지하기 위해 바늘을 제거합니다. <ol><li> , 혈장, 여기 항응고제 (EDTA로 포함되어 사용 튜브를 수집 혈액의 200 ~ 400 ㎕의 0.1 M EDTA 10 μl를 사용하려면, 확인 승을 방해하지 않는 사용 EDTA의 농도를얼음에 다운 스트림 분석) 및 장소 i 번째. <ol><li> 컬렉션의 10 분 내에서 10 분 동안 냉장 원심 분리기 (4 ° C)에서 2,100 XG에서 전체 혈액 샘플을 스핀. 적색 및 백혈구 층을 방해 회피 플라즈마를 용출. </li></ol></li><li> 응고 가능하도록 최대 30 분 동안 실온에서 혈청 (항응고제)없이 도시 샘플을 수집한다. 2,000 x g에서 냉장 원심 분리기 (4 ° C)에서 수집 튜브를 스핀. 혈청은 용출 될 수있다. </li></ol></li><li> 사용 즉시 샘플, 또는 저장 최대 1 년까지 -80 ° C에서. </li></ol>

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	<li>Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNAs+in+Patients+with+Acute+Myocardial+Infarction.">Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction.</a> Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).</li><li>Shah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Polyps:+Systematic+Review.">Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).</li><li>Chan, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+blood-based+protein+biomarker+strategies+in+the+study+of+psychiatric+disorders.">Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders.</a> Prog Neurobiol. , (2014).</li><li>Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+induces+learning+impairment+that+is+mediated+by+interleukin+1beta+in+rodents.">Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents.</a> PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).</li><li>Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+impairment+of+acquisition+of+a+spatial+memory+task+following+isoflurane-nitrous+oxide+anesthesia+in+rats.">Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats.</a> Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).</li><li>Vahl, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+ACTH+and+corticosterone+sampling+methods+in+rats.">Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).</li><li>Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynorphin,+stress,+and+depression.">Dynorphin, stress, and depression.</a> Brain Res. 1314 (56-73), (2010).</li><li>Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical/hippocampal+monoamines,+HPA-axis+changes+and+aversive+behavior+following+stress+and+restress+in+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder.">Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder.</a> Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기, 우리가 일반적으로 사용되는 다른 기술에 비해 상당한 장점을 제공하는 쥐에서 혈액 샘플을 얻기위한 빠르고 간단한 절차를 설명합니다. 첫째, 경정맥 또는 안와 부비동에서 샘플링과는 대조적으로, 마취를 필요로하지 않는다. 혈액 샘플은 행동 절차를 둘러싸 수집 때 학습 및 기억 4,5- 방해 할 수 있기 때문에, 마취제 투여는 바람직하지 않다. 둘째, 이러한 복재 또는 등쪽 페달 정맥에서 정맥 천자 컬렉션과 같은 다른 기술에 비해 더 큰 부피의 혈액을 수집하는 능력을 제공한다. 혈액 1.5ml의 최대, 여기에 설명 된 기술을 사용하는 것은 하나의 시점에 쥐로부터 수집 될 수 있고, 용이하게 복수의 분석이 병렬로 실행될 수 있도록 볼륨. 마지막으로,이 절차는 꼬리 끝 절단 또는 안와 후 출혈에 비해 조직 손상에 대한 가능성을 최소화한다. 이 절차의 사용은 동물 W 준수를 용이elfare 법 및 동물 실험 수행 절차의 결과 통증과 고통을 최소화 할 필요가 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 안내서. 또한이 방법으로 연구자들이 새로운 실험 동물을 억제되는 시간을 최소화하기 위해 구속 꼬리 출혈 기술을 실행하는 것이 권장된다. 구속의 개시에서보다 3 분에서 수집 된 혈액은 최적의 결과를 제공합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 주 당 1 내지 4 회 샘플링에 사용되지 않지만 하루 두번보다 더 될 수있다. 반복 된 혈액 수집이 수행 될 수 있지만, 꼬리의베이스로부터 위쪽으로 움직이는 다른 샘플링 위치가 사용되어야하며, 좌우 꼬리 정맥을 샘플링 위치로 교대한다. 설치류의 총 혈액량은 체중 6-7 %로하고, 전체 혈액의 부피 기준 15 % 이상이 2 주 기간 내에 수집 될 수 없습니다. 혈청또는 플라즈마는 수집 된 샘플 부피의 약 40 % -60 %를 포함한다. 몇몇 사소한 변형으로 여기 기술 된 바와 같이 측면 꼬리 정맥을 통해 혈액 샘플링은 또한 마우스에서 수행 될 수있다. 우선, 단지 작은 게이지 (27 G) 카테터를 사용할 수있다. 둘째로, 그것은 마우스 고정화 오히려 랩보다 튜브 제한 수단을 사용하는 것이 권장된다. 턱밑 관다발 (200-500 μL)을 사용하여 정맥 천자의 마우스로부터 수득 될 수있다 혈액의 부피는 안전하게 꼬리 정맥 (200 μL 최대)에서 수집 될 수있는 것보다 더 크다. 턱밑 관다발에서 혈액을 샘플링하는 것은 최소한의 구속을 필요로하고 더 많은 혈액을 얻을 수 있기 때문에,이 마우스에서 샘플링 선호하는 노선이다. 이 절차는 그 최소 침습 자연과 함께 수행 될 수있는 신속성은 또한 급성 스트레스 반응 (6)에 의해 혈액 계 조치 섭동 가능성을 최소화한다.급성 스트레스 반응은 인터루킨과 다른 면역 활성 ​​인자 (7), 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 축 (8)의 호르몬, 교감 신경계 9 호르몬, 그렐린 (10), 내인성 오피오이드 (11), 도파민 등 많은 분자의 순환 수준을 변경, 수 세로토닌 (12). 이러한 분자들에 의해 조절이 분자 또는 다른 휴식 순환 대책이 요구되는 경우, 스트레스 노광 개시 분만큼 작은 내에 트리거 스트레스 반응을 최소화하는 것이 중요하다. 스트레스 반응은 혈액의 성분을 변경할뿐만 아니라 교감 신경계를 통해 드라이브 증가 때문에 혈관의 수축의 혈액 샘플링을위한 기술적 장애물을 나타내지. 이것은 급성 스트레스 반응 장착되어 정상 래트에서 혈류를 증가 얻는 것이 곤란해진다. 따라서, 동물의 고통은 미님해야합니다급속하게 관심 생리 상태를 반영 샘플들을 획득하기 위해화된.

혈액에서 얻은 바이오 마커는 유용한 진단, 예측을 제공하고, 심혈관 질환 1, 암 과학 2, 정신 질환 (3)를 포함하여 많은 임상 상황에서 조치를 계층화. 또한 기아, 염증, 또는 응력의 존재도 포함하여, 유기체의 &quot;상태&quot;를 평가하는 기초 연구에 사용될 수있다. 그러한 조치는 또는 샘플이 얻어 일의 시간 및 주제 성별 포함 관심 질문에 중요하지 않을 수도 변수에 의해 영향을받을 수있다. 또한 채혈 절차 자체 동안에 유도 된 응력에 의해 영향을받을 수있다. 스트레스 호르몬과 통증의 지각이 빠르게 혈액의 조성을 변경할 수있다. 설치류가 가장 일반적으로 사용되는 실험용 동물이며, 여러 방법은 채혈을 위해 개발되어왔다. 혈액 샘플링의 이상적인 방법은 최소한의 physiologica이 있어야합니다동물에 L에 미치는 영향은 어떤 마취를 필요로하지, 신속하고 반복 샘플링을 허용하고, 다수의 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 충분한 혈액량을 제공합니다. 이들 기준을 충족하지 않는 경정맥 또는 꼬리 끝의 절단의 카테터로 혈액을 수집하기위한 인기있는 기술. 이 프로토콜의 목적은, 마취가 필요하지 않고, 최소한의 스트레스 래트에서 사용하기위한 혈액 샘플링 기술을 설명하는 단일 주체 내에서 여러 혈액 수집을 허용하고, 다수의 분석이 수행 될 수 있도록 상대적으로 큰 샘플 부피를 제공한다 하나의 샘플에. 이 방법의 목적은 최소 급성 스트레스 반응에 의해 영향을 받는다 혈액 샘플을 획득하는 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium heparin (1000 USP units/ml)</td>
			<td>Patternson Veterinary Supply</td>
			<td>25021040010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>JT Taylor</td>
			<td>JT2020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermachlor Rinse-Chlorhexadine</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>6356</td>
			<td>Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>TESV25BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin 1cc syringes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BD309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89202-682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#956;l microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>21150-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, stainless steel, 5&#34;</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml plastic beaker</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>414004-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean cloth wrap</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Velcro tape, .75&#34; width</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>B004AF9II6</td>
			<td>Hook and loop tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling blood from the lateral tail vein of the rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

프로토콜에 설명 된대로 측면 꼬리 정맥에서 수집 혈장은 반투명과 모양의 담황색했다 플라즈마 샘플을 제공합니다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 샘플에서의 용혈은 플라즈마에 붉은 색조를 부여한다. 급성 스트레스 반응은 신속하게 혈액의 성분을 변경할 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이 예를 들어, 순환 코르티 코스 테론 농도는 현저하게, 스트레스에 노출 10 분 내에 증가시킬 수있다. 노출 스트레스 전에이 방법으로 얻어진 코르티 코스 테론의 낮은 기저 수준은 샘플링 절차 자체가 응력의 현저한 소스 아니라는 것을 알 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig1.jpg" /> 그림 1. 샘플 외관 (A) 용혈 시료를 나타낸다. 원심 분리 후, 혈장 또는 혈청 층 (표면이 검은 AR로 나타낸행) 분홍색 또는 빨간색으로 물들어 나타납니다. 어두운 색조는 용혈의 높은 수준을 나타냅니다. (B)를 원심 분리 후, 적절하게 수집 된 샘플은 비 용혈 혈장 또는 혈청에 해당하는 상위 대역 (검은 색 화살표로 표시된 표면)에 명확한, 황색 모양을해야합니다. 이 층을 제거 할 때, 어느 전혈 층으로 피펫 팁을 누름으로써 또는 팁에 전체 혈액의 일부를 흡입하여 하부 전혈을 방해하지 않는 것이 중요하다. 전체 혈액에 오염 된 모든 혈장 또는 혈청을 폐기해야합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig2.jpg" /> 그림 2 : 플라즈마 코르티 코스 테론이 빠르게 스트레스를 경험 다음 상승 혈액 전에 성인 여성의 긴 에반스 쥐의 측면 꼬리 정맥에서 얻은 10 분 4 톤 (10 초, 2 kHz에서 85 dB)로 노출 다음 공동 종료되었다. foo에와tshocks (1 초, 350 μA). 기준선 (290.4 ± 138.8 PG / ㎖)에서 혈장 코르티는 레벨 footshock 응력 프레젠테이션 다음 10 분간 관찰보다 훨씬 적었다 (2204.8 ± 454.5 PG / ㎖, p = 0.02, N = 4), 한 쌍의 t에 의해 결정 -test. * P &lt;0.05

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Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

쥐의 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

101.8K 조회수.  Massachusetts Institute of Technology. Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

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Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

Saphenous 베인 통해 심장 찔린로 쥐에서 혈액을 그리기

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

연구

생물학

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

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RNA 또는 특정 뇌 영역에서 단백질 추출에 대한 쥐 두뇌의 마이크로 해부

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

StemCell 기술에서 RosetteSep 키트와 함께 인간의 피를에서 NK 세포의 농축

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

미국 호르세쇼 게, Limulus Polyphemus의 혈액 수집

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Biomechanical 및 Mechanobiological 연구 랫 타일 힘줄의 준비

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

기니 돼지의 비 터미널 혈액 샘플링 기법

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for detecting the successful establishment of blood chimerism in parabionts by a caudal vein injection of glucose. Parabiotic mice were constructed. Glucose was injected into the donor mouse through the tail vein, and the fluctuation of blood glucose level was measured in both mice using a blood glucometer at different time points. Our results showed that after glucose injection, the blood glucose level in donor mice increased sharply after 1 min and decreased slowly thereafter. Meanwhile, the blood glucose level of the recipient mice peaked 15 min after injection. Similar results were obtained with Evans blue, used as a positive control for glucose. The synchronous fluctuation of blood glucose levels indicates that blood flow between the two mice was established successfully.

Here we describe a new method of detecting successful establishment of shared blood circulation of two parabionts through a caudal vein injection of glucose, which causes minimal damage and is not fatal to the parabionts.

카달 정맥 포도당 주사에 의한 파라바이오틱 마우스의 공유 혈액 공급 확립 감지

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...