Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle proteine integrali della membrana come lo stato oligomerico, le loro dimensioni, la forma complessiva e la struttura a bassa risoluzione in soluzione. Gli studi di soluzione delle proteine di membrana richiedono molecole stabilizzanti come i detergenti. Questa tecnica ha il vantaggio di rende invisibili i detergenti ed evidenzia il segnale della proteina della membrana.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono a molte domande di ricerca biologica e medica perché oltre 1/3 delle proteine risiedono in membrane in cui svolgono molte funzioni cellulari vitali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di etichettatura del deuterio e di scattering neutronico sono difficili da apprendere perché pochissime istituzioni offrono formazione su queste tecniche. Per iniziare, determinare densità di lunghezza di dispersione neutronica o S SLD utilizzando l'applicazione web MULCh, moduli per l'analisi dei dati di variazione del contrasto.
Aprire il modulo di contrasto facendo clic sul contrasto nel riquadro di spostamento sinistro. Fornire il testo per un titolo di progetto e immettere i dettagli seguenti per due componenti come subunità uno e subunità due. Immettere la formula molecolare per ogni componente nella casella di testo della formula.
Quindi immettere il volume in angstrom cubici per ogni componente nella casella sotto il volume. Infine, immettere i dettagli per i componenti del buffer. Fare clic su invia per eseguire i calcoli del contrasto neutronico.
Viene generata una pagina dei risultati che fornisce una tabella della densità della lunghezza di dispersione e dei punti di corrispondenza del contrasto, nonché formule per determinare questi parametri a una determinata percentuale di D2O nel buffer. Esaminare i parametri di dispersione con particolare attenzione ai punti di corrispondenza del contrasto dei componenti. Far crescere le cellule E.coli che ospitano un vettore di espressione induttibile per la sequenza proteica bersaglio in mezzo LB a una densità ottica a 600 nanometri o OD 600 di circa uno.
Adattare le cellule E.coli al deuterio etichettato medio prima di scalare per l'espressione sovrastante di una proteina deuterata diluire la coltura LB da uno a 20 millilitri su tre di mezzo minimo. Dopo essere cresciuto fino a un OD 600 di circa uno, ripetere da una a 20 diluizioni utilizzando un supporto minimo contenente 50, 75 e 100%D2O. Una volta adattato, continua a coltivare la coltura in un bioreattore per aumentare la resa della massa cellulare deuterata.
Con l'aumento del contenuto D2O, i tassi di crescita diminuiranno. Procedere alla raccolta, alla lisciga e alla purificazione delle cellule come descritto nel protocollo di testo. Successivamente equilibrare una colonna di esclusione delle dimensioni con più di due volumi di colonna di buffer di scambio finale utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce.
Dopo aver iniettato il campione, eseguire la colonna in frazioni isolate corrispondenti alla proteina di interesse. Riservare un'aliquota di buffer abbinato per lo scattering neutronico ad angolo ridotto o la sottrazione di fondo SANS. Per raccogliere i dati SANS, caricare prima campioni e buffer nelle celle al quarzo.
Dopo aver fatto in modo che l'otturatore del fascio sia chiuso, avvicinarsi all'area dell'ambiente del campione e posizionare le celle al quarzo nel cambio campione. Registrare la posizione del changer di esempio per ogni cella di esempio. Controllare l'area e assicurarsi che il percorso del fascio sia privo di ostruzioni prima di lasciare l'area dell'ambiente campione.
Quindi aprire l'otturatore del fascio. Eseguire un'analisi della tabella per la raccolta automatica dei dati. Seguire le istruzioni per il funzionamento dello strumento fornite dallo scienziato dello scattering neutronico.
Usa il software Mantid Plot e lo script Python per la riduzione dei dati SANS da un'immagine 2D a un grafico 1D. A tale fine, accedere al cluster di analisi remota ed eseguire il plottaggio Mantid dalla riga di comando. Quindi aprire lo script di riduzione utente fornito e inserire i numeri di scansione o l'identificazione corrispondenti per l'esempio in coppie di buffer nell'elenco appropriato.
Eseguire lo script per generare dati ridotti come file di testo a quattro colonne nel percorso specificato. Fate clic con il pulsante destro del mouse sull'apposito spazio di lavoro e sul plottaggio Mantid e selezionate traccia con errori per un esame iniziale dei profili di dispersione. Scarica la suite di software ATSAS e utilizza PRIMUS per il plottaggio dei dati, il ridimensionamento e la sottrazione del buffer e l'analisi guinier.
Avviare l'applicazione di analisi dei dati ATSAS, SAS e caricare i file di dati ridotti corrispondenti alla coppia di esempi e buffer. Per ridimensionare correttamente il buffer, selezionare l'intervallo di dati in Q alto in cui entrambi i profili sono simili in piano e fare clic sul pulsante scala che si trova sotto la scheda operazioni. Aumentare l'intervallo di dati per visualizzare tutti i punti, fare clic su sottrai per eseguire questa operazione.
Eseguire un'analisi Guinier dei dati di esempio sottratti dal buffer utilizzando la scheda analisi dell'applicazione di analisi dei dati SAS. Assicurarsi che il file corretto sia selezionato nell'elenco e fare clic sul raggio di rotazione. Un tentativo automatizzato di eseguire una vestibilità Guinier verrà fornito facendo clic sul pulsante RG automatico.
Espandere l'intervallo di dati utilizzato per includere tutti i dati Q bassi e iniziare a restringere l'intervallo di dati togliendo punti Q elevati fino a quando il limite Q max per RG è inferiore a 1,3. Utilizzare il grafico dei residui per verificare che i dati siano lineari nell'intervallo di adattamento. Apportare piccole regolazioni alla regione di adattamento e monitorare la sensibilità di questi valori all'intervallo di dati utilizzati nell'adattamento.
Ottenere la funzione di distribuzione di probabilità P di R nello gnomo. Avviare ora la distribuzione guidata della distanza all'interno della scheda analisi. Ottenere una buona vestibilità ai dati è essenziale per ottenere un modello di qualità.
Determinare Dmax, la distanza interatomica massima all'interno della molecola. Stimare un valore per Dmax deselezionando la casella per forzare Rmax uguale a zero e immettendo un valore elevato per Dmax. La prima intercetta X nella trama di P di R produce questa stima.
Apportare modifiche incrementali a questo valore Dmax e all'intervallo di dati utilizzato per il numero di punti utilizzati per ottimizzare lo gnomo adatto ai dati e alla curva P di R risultante. Avviare la creazione guidata forma PRIMUS dal pulsante dammif nella scheda analisi dell'analisi dei dati SAS e utilizzare una selezione manuale dei parametri. Definire la gamma Guinier dall'adattamento e procedere al passaggio successivo utilizzando i pulsanti di navigazione.
Definite i valori di adattamento dal plottaggio P di R e procedete al passo successivo. Fornire parametri per il processo di modellazione ab initio. Quindi avviare il processo utilizzando il pulsante di commit.
Sovrapporre e sovrapporre l'involucro finale sans con un modello ad alta risoluzione correlato utilizzando supcomb all'interno di ATSAS. Inserire una copia del modello PDB ad alta risoluzione da adattare all'inviluppo SANS nella directory di lavoro. Quindi eseguire supcomb dalla riga di comando utilizzando i nomi dei file PDB come due argomenti con la struttura del modello elencata per prima.
Infine visualizzare i risultati del modello ab initio utilizzando PyMOL, un programma di visualizzazione grafica molecolare 3D. Una volta sovrapposti l'inviluppo SANS e la struttura ad alta risoluzione, questi modelli possono essere visualizzati utilizzando qualsiasi programma di visualizzazione grafica molecolare. Viene visualizzata una panoramica del processo di visualizzazione PyMOL.
Una volta aperti i file della struttura PDB in PyMOL, i modelli dovrebbero essere visibili nella finestra del visualizzatore PyMOL. Le rappresentazioni di ogni modello possono essere modificate utilizzando il pulsante S accanto a ciascun nome di file. Qui viene utilizzata una rappresentazione di superficie per l'inviluppo SANS e una rappresentazione cartoon viene utilizzata per la spina dorsale proteica del modello ad alta risoluzione.
Una combinazione di colori adatta può essere selezionata tra le opzioni disponibili sotto il pulsante C. Per le catene proteiche, una colorazione a catena fornisce un gradiente di colore dal capolinea N a C per aiutare l'interpretazione. La trasparenza viene applicata alla rappresentazione superficiale per consentire una migliore visualizzazione della struttura proteica all'interno dell'involucro.
Per le immagini di pubblicazione, è consigliato uno sfondo bianco. Una volta applicati questi segnali di visualizzazione, le strutture 3D possono essere esaminate facendo clic e trascinando la struttura. È possibile eseguire manipolazioni della rotazione e della traslazione della prospettiva e della molecola.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di abbinare accuratamente il contrasto neutronico dei gruppi testa e coda del detergente con il solvente D2O H2O. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada all'esplorazione della struttura delle asparto proteasi intramembrane. Queste proteine sono coinvolte nella risposta immunitaria, nell'epatite C e nel morbo di Alzheimer.
Non dimenticate che lavorare in laboratori biochimici e in impianti di fascio di neutroni può essere pericoloso. Precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale e seguire tutte le regole di sicurezza dell'impianto e i distacchi radiologici sono obbligatori durante l'esecuzione di questa procedura.
