この方法は、オリゴマー状態、そのサイズ、全体的な形状、溶液中の低解像度構造などの一体性膜タンパク質に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。膜タンパク質の溶液研究では、洗剤のような分子を安定化させる必要があります。この技術は、洗剤を見えなくし、膜タンパク質からのシグナルを強調するという利点があります。
タンパク質の1/3以上は、多くの重要な細胞機能を実行する膜に存在するため、この技術の意味は、多くの生物学的および医学的研究の質問に及ぶ。重水素標識と中性子散乱ステップは、これらの技術の訓練を提供する機関が非常に少ないため、この方法の視覚的なデモンストレーションが重要です。まず、コントラスト変動データの解析用モジュールである「マルチ」を使用して中性子散乱長さ密度またはSLを決定します。
左側のナビゲーション ペインにあるコントラストをクリックして、コントラスト モジュールを開きます。プロジェクトタイトルのテキストを入力し、サブユニット 1 とサブユニット 2 として 2 つのコンポーネントの詳細を入力します。数式テキスト ボックスに、各コンポーネントの分子式を入力します。
次に、体積の下のボックスに各コンポーネントの三方オングストロームでボリュームを入力します。最後に、バッファ コンポーネントの詳細を入力します。[送信]をクリックして中性子のコントラスト計算を実行します。
結果ページは、散乱長密度とコントラストマッチポイントのテーブルを提供するとともに、バッファー内の任意の割合の D2O でこれらのパラメーターを決定するための式を提供します。コンポーネントのコントラストマッチポイントに特に注意を払って、散乱パラメータを確認します。LB培地中の標的タンパク質配列に対する誘導発現ベクターを有する大腸菌細胞を、600ナノメートルまたはOD600程度の光学密度に成長させる。
LB培養物を3ミリリットルの最小培地で1~20に希釈することにより、重タンパク質の過剰発現のためにスケールアップする前に大腸菌細胞を重水素標識培地に適応させる。約1個のOD600に成長させた後、50、75、および100%D2Oを含む最小培地を使用して1〜20希釈を繰り返します。一度適応したら、重水素細胞塊の収率を増加させるためにバイオリアクターで培養を成長させ続ける。
D2Oの含有量が増加すると、成長率が低下します。テキストプロトコルに記載されているように、収穫、ライス、および細胞を浄化するに進みます。次に、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムを使用して、最終交換バッファーの2カラムを超える体積を有するサイズ排除カラムを平衡化する。
サンプルを注入した後、目的のタンパク質に対応する分画を分離してカラムを実行する。小角中性子散乱またはSANSバックグラウンド減算のために、一致したバッファのアリコートを予約します。SANS データを収集するには、まずサンプルとバッファを Quartz セルに読み込みます。
ビームシャッターが閉じられていることを確認した後、サンプル環境領域に近づき、クォーツセルをサンプルチェンジャに入れます。各サンプルセルのサンプルチェンジャー位置を記録します。サンプル環境領域を離れる前に、領域を確認し、ビームパスが障害物がないことを確認します。
次に、ビームシャッターを開きます。自動データ収集のテーブルスキャンを実行します。中性子散乱科学者が提供する計器操作の指示に従ってください。
2D 画像から 1D プロットへの SANS データの削減には、Mantid プロット ソフトウェアと Python スクリプトを使用します。これを行うには、リモート分析クラスタにログインし、コマンドラインからMantidプロットを実行します。次に、提供されたユーザー削減スクリプトを開き、サンプルの対応するスキャン番号または識別情報をバッファーペアの適切なリストに入れます。
スクリプトを実行して、指定した場所に 4 列のテキスト ファイルとして縮小されたデータを生成します。適切な作業空間とマンティッドプロットを右クリックし、散乱プロファイルの初期検査でエラーのあるプロットを選択します。ATSASソフトウェアスイートをダウンロードし、データプロット、バッファスケーリングと減算、Guinier分析にPRIMUSを使用します。
ATSAS SAS データ分析アプリケーションを起動し、サンプルとバッファーのペアに対応する削減データ・ファイルをロードします。バッファを適切にスケーリングするには、両方のプロファイルがフラットで類似している高 Q のデータ範囲を選択し、[操作] タブの下にあるスケール ボタンをクリックします。データ範囲を大きくしてすべてのポイントを表示し、減算をクリックしてこの操作を実行します。
SAS データ分析アプリケーションの分析タブを使用して、バッファー減算サンプル データの Guinier 分析を実行します。リストで適切なファイルが選択されていることを確認し、[ジャイロの半径]をクリックします。Guinierフィットを実行する自動試みは、自動RGボタンをクリックして提供されます。
低 Q データをすべて含めるために使用されるデータ範囲を拡大し、Q 最大時間 RG が 1.3 を下回るまで高い Q ポイントを取り除くことによって、データ範囲を絞り込みます。残差のプロットを使用して、データが適合範囲内で線形であることを確認します。適合領域を微調整し、適合で使用されるデータ範囲に対するこれらの値の感度を監視します。
GnomeでRの確率分布関数Pを求める。次に、[解析] タブで距離分布ウィザードを開始します。データに適した適合性を得ることは、品質モデルを取得するために不可欠です。
分子内の最大原子間距離であるDmaxを決定します。Rmax を強制的にゼロにするチェックボックスをオフにし、Dmax に大きな値を入力して、Dmax の値を推定します。RのPのプロットの最初のX切片は、この推定値を生成します。
この Dmax 値に加え、データに適合するノームと R カーブの結果 P を最適化するために使用されるポイント数に使用されるデータの範囲を段階的に変更します。SAS データ分析の解析タブの dammif ボタンから PRIMUS シェイプウィザードを起動し、パラメータを手動で選択します。適合から Guinier 範囲を定義し、ナビゲーションボタンを使用して次のステップに進みます。
R プロットの P から適合値を定義し、次のステップに進みます。ab initio モデリング プロセスのパラメータを指定します。次に、コミット ボタンを使用してプロセスを開始します。
ATSAS内のサプコームを使用して、関連する高解像度モデルで最終的なサンエンベロープをオーバーレイして重ね合わせます。作業ディレクトリの SANS エンベロープに合わせて高解像度 PDB モデルのコピーを配置します。次に、PDB ファイル名を最初にリストしたテンプレート構造を持つ 2 つの引数として、コマンド行から supcomb を実行します。
最後に、3D分子グラフィックス表示プログラムPyMOLを使用して、ab initioモデルの結果を視覚化します。SANSエンベロープと高解像度構造を重ね合わせ、これらのモデルは、任意の分子グラフィックス表示プログラムを使用して可視化することができます。PyMOL可視化プロセスの概要を示します。
PDB構造ファイルがPyMOLで開かれたら、モデルはPyMOLビューアウィンドウに表示されるはずです。各モデルの表現は、各ファイル名の横にある S ボタンを使用して変更できます。ここでは、SANSエンベロープに表面表現が使用され、高解像度モデルのタンパク質バックボーンに漫画表現が使用されます。
適切なカラースキームは、Cボタンの下で利用可能なオプションから選択することができます。タンパク質鎖の場合、チェーンボウカラーリングは、解釈を助けるためにNからC末語までの色勾配を提供します。透明化は、エンベロープ内のタンパク質構造をより良く視覚化できるように、サーフェス表現に適用されます。
文書の画像の場合は、白い背景を使用することをお勧めします。これらの視覚化キューが適用されると、3D 構造をクリックしてドラッグすることで、3D 構造を調べることができます。遠近法や分子の回転や移動の操作が行えます。
この手順を試みている間は、D2O H2O溶媒と洗剤ヘッドとテールの中性子のコントラストを正確に一致させることが重要です。開発後、この技術は膜内アスパルトプロテアーゼの構造を探索する道を開いた。これらのタンパク質は、免疫応答、C型肝炎およびアルツハイマー病に関与している。
生化学研究所や中性子ビーム施設で働くことは危険であり得るということを忘れないでください。この手順を実行する場合は、個人用保護具の着用、施設の安全規則および放射線ポスティングをすべて遵守するなどの注意事項が必須です。
