Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre proteínas de membrana integral, como o estado oligomerico, seu tamanho, forma geral e estrutura de baixa resolução na solução. Estudos de solução de proteínas de membrana requer moléculas estabilizadoras como detergentes. Essa técnica tem a vantagem de que torna os detergentes invisíveis e destaca o sinal da proteína da membrana.
As implicações dessa técnica se estendem a muitas questões de pesquisa biológica e médica porque mais de 1/3 das proteínas residem em membranas onde realizam muitas funções celulares vitais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a rotulagem de deutério e as etapas de dispersão de nêutrons são difíceis de aprender porque pouquíssimas instituições oferecem treinamento nessas técnicas. Para começar, determine densidades de comprimento de dispersão de nêutrons ou SLDs usando o aplicativo web MULCh, módulos para a análise de dados de variação de contraste.
Abra o módulo de contraste clicando em contraste localizado no painel de navegação esquerdo. Forneça texto para um título de projeto e insira os detalhes abaixo para dois componentes como subunnit um e subunit dois. Digite a fórmula molecular de cada componente na caixa de texto da fórmula.
Em seguida, digite o volume em angstroms cúbicos para cada componente na caixa abaixo do volume. Por fim, digite os detalhes para componentes de buffer. Clique em enviar para realizar os cálculos de contraste de nêutrons.
Uma página de resultados é gerada que fornece uma tabela de densidade de comprimento de dispersão e match points de contraste, bem como fórmulas para determinar esses parâmetros em qualquer porcentagem de D2O no buffer. Revise os parâmetros de dispersão com especial atenção aos match points de contraste do componente. Crescer células E.coli abrigando um vetor de expressão indutível para a sequência proteica alvo em meio LB para uma densidade óptica a 600 nanômetros ou OD 600 de aproximadamente um.
Adapte as células E.coli ao deutério rotulado de meio antes de escalar para a expressão excessiva de uma proteína deuterada diluindo a cultura LB de um a 20 em três mililitros de meio mínimo. Depois de crescer para um OD 600 de aproximadamente um, repita o de uma a 20 diluições usando meio mínimo contendo 50, 75 e 100% D2O. Uma vez adaptado, continue crescendo a cultura em um bioreator para aumentar o rendimento da massa celular deuterada.
À medida que o conteúdo D2O é aumentado, as taxas de crescimento diminuirão. Proceder à colheita, lise e purificação de células conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida equilibre uma coluna de exclusão de tamanho com volumes maiores que duas colunas de buffer de troca final usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida.
Após injetar a amostra, execute a coluna em frações isoladas correspondentes à proteína de interesse. Reserve uma alíquota de tampão compatível para dispersão de nêutrons de pequeno ângulo ou subtração de fundo SANS. Para coletar dados sans, primeiro carregar amostras e buffers em células de quartzo.
Depois de garantir que o obturador do feixe esteja fechado, aproxime-se da área do ambiente da amostra e coloque as células de quartzo no trocador de amostras. Regisso destaque para cada célula amostral. Verifique a área e certifique-se de que o caminho do feixe está livre de obstrução antes de sair da área do ambiente da amostra.
Em seguida, abra o obturador do feixe. Execute uma varredura de tabela para coleta automatizada de dados. Siga as instruções para a operação do instrumento fornecidas pelo cientista de dispersão de nêutrons.
Use o software Mantid Plot e o script Python para a redução dos dados SANS de uma imagem 2D para um plot 1D. Para isso, faça login no cluster de análise remota e execute o plano Mantid da linha de comando. Em seguida, abra o script de redução do usuário fornecido e coloque os números de varredura correspondentes ou identificação para a amostra em pares de buffer na lista apropriada.
Execute o script para gerar dados reduzidos como um arquivo de texto de quatro colunas no local especificado. Clique com o botão direito do mouse no espaço de trabalho apropriado e no enredo mantid e selecione plot com erros para um exame inicial dos perfis de dispersão. Baixe o conjunto de software ATSAS e use o PRIMUS para plotagem de dados, escala de buffer e subtração e análises de Guinier.
Inicie o aplicativo de análise de dados ATSAS, SAS e carregue os arquivos de dados reduzidos correspondentes ao par de amostras e buffer. Para dimensionar o buffer corretamente, selecione a faixa de dados em Q alto, onde ambos os perfis são semelhantes em plano e clique no botão de escala localizado sob a guia de operações. Aumente o intervalo de dados para visualizar todos os pontos, clique em subtrair para realizar esta operação.
Realize uma análise guinier dos dados amostrais subtraídos do buffer usando a guia de análise do aplicativo de análise de dados SAS. Certifique-se de que o arquivo adequado está selecionado na lista e clique em raio de giro. Uma tentativa automatizada de realizar um ajuste Guinier será fornecida clicando no botão RG automático.
Expanda a gama de dados usados para incluir todos os dados Q baixos e comece a reduzir o intervalo de dados tirando pontos Q altos até que o limite de RG máximo q esteja abaixo de 1,3. Use o gráfico de resíduos para verificar se os dados são lineares na faixa de ajuste. Faça pequenos ajustes na região de ajuste e monitore a sensibilidade desses valores à gama de dados utilizados no ajuste.
Obtenha a função de distribuição de probabilidade P de R no gnomo. Agora inicie o assistente de distribuição de distância dentro da guia de análise. Obter um bom ajuste aos dados é essencial para a obtenção de um modelo de qualidade.
Determine Dmax, a distância interatômica máxima dentro da molécula. Estime um valor para Dmax desmarcando a caixa para forçar Rmax igual a zero e digitando um grande valor para Dmax. A primeira interceptação X na trama de P de R rende esta estimativa.
Faça alterações incrementais nesse valor Dmax, bem como a gama de dados utilizados para o número de pontos usados para otimizar o gnomo adequado aos dados e à curva P de R resultante. Inicie o assistente de forma PRIMUS a partir do botão dammif na guia de análise da análise de dados SAS e use uma seleção manual de parâmetros. Defina a gama Guinier desde o ajuste e prossiga para o próximo passo usando os botões de navegação.
Defina valores de ajuste a partir do gráfico P de R e proceda para o próximo passo. Fornecer parâmetros para o processo de modelagem ab initio. Em seguida, inicie o processo usando o botão cometer.
Sobreponha e sobreponha o envelope final sans com um modelo relacionado de alta resolução usando supcomb dentro do ATSAS. Coloque uma cópia do modelo PDB de alta resolução para caber no envelope SANS no diretório de trabalho. Em seguida, execute supcomb da linha de comando usando os nomes dos arquivos PDB como dois argumentos com a estrutura de modelo listada primeiro.
Finalmente visualize os resultados do modelo ab initio usando o PyMOL, um programa de visualização de gráficos moleculares 3D. Uma vez que o envelope SANS e a estrutura de alta resolução tenham sido sobrepostos, esses modelos podem ser visualizados usando qualquer programa de visualização de gráficos moleculares. Uma visão geral do processo de visualização do PyMOL é mostrada.
Uma vez que os arquivos de estrutura PDB tenham sido abertos em PyMOL, os modelos devem ser visíveis na janela do visualizador PyMOL. As representações de cada modelo podem ser alteradas usando o botão S ao lado de cada nome do arquivo. Aqui uma representação superficial é usada para o envelope SANS e uma representação de desenho animado é usada para a espinha dorsal da proteína do modelo de alta resolução.
Um esquema de cores adequado pode ser selecionado entre as opções disponíveis no botão C. Para cadeias proteicas, uma coloração de chainbow fornece um gradiente de cor de n a c terminus para auxiliar a interpretação. A transparência é aplicada à representação superficial para permitir uma melhor visualização da estrutura proteica dentro do envelope.
Para imagens de publicação, recomenda-se um fundo branco. Uma vez que essas pistas de visualização tenham sido aplicadas, as estruturas 3D podem ser examinadas clicando e arrastando a estrutura. Manipulações da perspectiva e rotação de moléculas e tradução podem ser realizadas.
Ao tentar este procedimento é importante lembrar-se de combinar com precisão o contraste de nêutrons dos grupos de cabeça e cauda detergente com o solvente D2O H2O. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para explorar a estrutura de proteases intramembrana asparto. Essas proteínas estão envolvidas na resposta imune, hepatite C e doença de Alzheimer.
Não se esqueça que trabalhar em laboratórios bioquímicos e em instalações de vigas de nêutrons pode ser perigoso. Precauções como usar equipamentos de proteção individual e seguir todas as regras de segurança das instalações e postagens radiológicas são obrigatórias durante a realização deste procedimento.
