Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las proteínas de membrana integral como el estado oligomérico, su tamaño, forma general y estructura de baja resolución en solución. Los estudios de soluciones de proteínas de membrana requieren estabilizar moléculas como detergentes. Esta técnica tiene la ventaja de que hace que los detergentes sean invisibles y resalta la señal de la proteína de membrana.
Las implicaciones de esta técnica se extienden a muchas preguntas de investigación biológica y médica porque más de 1/3 de proteínas residen en membranas donde realizan muchas funciones celulares vitales. La demostración visual de este método es fundamental ya que el etiquetado de deuterio y los pasos de dispersión de neutrones son difíciles de aprender porque muy pocas instituciones ofrecen capacitación en estas técnicas. Para empezar, determine las densidades de longitud de dispersión de neutrones o SLD utilizando la aplicación web MULCh, módulos para el análisis de datos de variación de contraste.
Abra el módulo de contraste haciendo clic en contraste situado en el panel de navegación izquierdo. Proporcione texto para un título de proyecto e introduzca los detalles siguientes para dos componentes como subunidad uno y subunidad dos. Introduzca la fórmula molecular para cada componente en el cuadro de texto de fórmula.
A continuación, introduzca el volumen en angstroms cúbicos para cada componente en el cuadro de abajo del volumen. Por último, introduzca los detalles de los componentes de búfer. Haga clic en Enviar para realizar los cálculos de contraste de neutrones.
Se genera una página de resultados que proporciona una tabla de densidad de longitud de dispersión y puntos de coincidencia de contraste, así como fórmulas para determinar estos parámetros en un porcentaje determinado de D2O en el búfer. Revise los parámetros de dispersión con especial atención a los puntos de coincidencia de contraste del componente. Cultivar células de E. coli que albergan un vector de expresión inducible para la secuencia de proteínas diana en medio LB a una densidad óptica a 600 nanómetros o OD 600 de aproximadamente uno.
Adaptar las células de E. coli al medio de deuterio etiquetado antes de escalar para la expresión excesiva de una proteína deuterada diluyendo el cultivo de LB de uno a 20 en tres mililitros de medio mínimo. Después de crecer a un OD 600 de aproximadamente uno, repita la de una a 20 diluciones utilizando un medio mínimo que contenga 50, 75 y 100%D2O. Una vez adaptado, continuar creciendo el cultivo en un biorreactor para aumentar el rendimiento de la masa celular deuterated.
A medida que aumenta el contenido de D2O, las tasas de crecimiento disminuirán. Proceder a la cosecha, lanse y purificar las células como se describe en el protocolo de texto. A continuación, equilibre una columna de exclusión de tamaño con volúmenes superiores a dos columnas de tampón de intercambio final utilizando un sistema de cromatografía líquida proteica rápida.
Después de inyectar la muestra, ejecute la columna en fracciones aisladas correspondientes a la proteína de interés. Reserve una alícuota de búfer coincidente para la dispersión de neutrones de ángulo pequeño o la resta de fondo SANS. Para recopilar datos SANS, primero cargue muestras y búferes en celdas de cuarzo.
Después de asegurarse de que el obturador del haz está cerrado, acérquese al área del entorno de la muestra y coloque las celdas de cuarzo en el cambiador de muestras. Registre la posición del cambiador de muestra para cada celda de muestra. Compruebe el área y asegúrese de que la trayectoria de la viga esté libre de obstrucciones antes de salir del área del entorno de la muestra.
A continuación, abra el obturador de la viga. Ejecute un análisis de tabla para la recopilación automatizada de datos. Siga las instrucciones para el funcionamiento del instrumento proporcionadas por el científico de dispersión de neutrones.
Utilice el software Mantid Plot y la secuencia de comandos de Python para la reducción de datos SANS de una imagen 2D a una gráfica 1D. Para ello, inicie sesión en el clúster de análisis remoto y ejecute el trazado Mantid desde la línea de comandos. A continuación, abra el script de reducción de usuario proporcionado y coloque los números de análisis o la identificación correspondientes para la muestra en pares de búferes en la lista adecuada.
Ejecute el script para generar datos reducidos como un archivo de texto de cuatro columnas en la ubicación especificada. Haga clic con el botón derecho en el espacio de trabajo adecuado y en el trazado mantid y seleccione el trazado con errores para un examen inicial de los perfiles de dispersión. Descargue la suite de software ATSAS y utilice PRIMUS para el trazado de datos, el escalado y la resta de búferes y el análisis de Guinier.
Inicie la aplicación de análisis de datos ATSAS, SAS y cargue los archivos de datos reducidos correspondientes al par de ejemplo y búfer. Para escalar el búfer correctamente, seleccione el rango de datos en Q alta donde ambos perfiles son similares en plano y haga clic en el botón de escala situado debajo de la pestaña de operaciones. Aumente el rango de datos para ver todos los puntos, haga clic en restar para realizar esta operación.
Realice un análisis Guinier de los datos de muestra restados por búfer mediante la pestaña de análisis de la aplicación de análisis de datos SAS. Asegúrese de que el archivo adecuado está seleccionado en la lista y haga clic en el radio de giro. Se proporcionará un intento automatizado de realizar un ajuste Guinier haciendo clic en el botón auto RG.
Amplíe el rango de datos utilizados para incluir todos los datos Q bajos y comience a reducir el rango de datos quitando puntos Q altos hasta que el límite Q max veces RG esté por debajo de 1.3. Utilice la gráfica de residuos para comprobar que los datos son lineales en el rango de ajuste. Realice pequeños ajustes en la región de ajuste y supervise la sensibilidad de estos valores al rango de datos utilizados en el ajuste.
Obtenga la función de distribución de probabilidad P de R en gnome. Ahora inicie el asistente de distribución de distancia en la pestaña de análisis. La obtención de un buen ajuste a los datos es esencial para obtener un modelo de calidad.
Determinar Dmax, la distancia interatómica máxima dentro de la molécula. Estimar un valor para Dmax desmarcando la casilla para forzar Rmax es igual a cero e introduciendo un valor grande para Dmax. La primera intercepción X en la gráfica de P de R produce esta estimación.
Realice cambios incrementales en este valor Dmax, así como en el rango de datos utilizados para el número de puntos utilizados para optimizar el ajuste del gnomo a los datos y a la P resultante de la curva R. Inicie el asistente de formas PRIMUS desde el botón dammif de la pestaña de análisis de datos SAS y utilice una selección manual de parámetros. Defina el rango Guinier desde el ajuste y continúe hasta el siguiente paso utilizando los botones de navegación.
Defina los valores de ajuste a partir de la gráfica P de R y continúe con el paso siguiente. Proporcione parámetros para el proceso de modelado ab initio. A continuación, inicie el proceso con el botón de confirmación.
Superponer y superponer el sobre sans final con un modelo de alta resolución relacionado usando supcomb dentro de ATSAS. Coloque una copia del modelo PDB de alta resolución que se ajuste al sobre SANS en el directorio de trabajo. A continuación, ejecute supcomb desde la línea de comandos utilizando los nombres de archivo PDB como dos argumentos con la estructura de plantilla enumerada en primer lugar.
Por último, visualice los resultados del modelo ab initio utilizando PyMOL, un programa de visualización de gráficos moleculares 3D. Una vez superpuesta la envolvente SANS y la estructura de alta resolución, estos modelos se pueden visualizar utilizando cualquier programa de visualización de gráficos moleculares. Se muestra una visión general del proceso de visualización PyMOL.
Una vez que los archivos de estructura PDB se han abierto en PyMOL, los modelos deben ser visibles en la ventana del visor PyMOL. Las representaciones de cada modelo se pueden cambiar mediante el botón S situado junto a cada nombre de archivo. Aquí se utiliza una representación de superficie para el sobre SANS y se utiliza una representación de dibujos animados para la columna vertebral de proteínas del modelo de alta resolución.
Se puede seleccionar un esquema de color adecuado entre las opciones disponibles bajo el botón C. Para las cadenas de proteínas, un colorante de arco de cadena proporciona un gradiente de color de N a C terminus para ayudar a la interpretación. La transparencia se aplica a la representación de la superficie para permitir una mejor visualización de la estructura proteica dentro de la envolvente.
Para las imágenes de publicación, se recomienda un fondo blanco. Una vez aplicadas estas indicaciones de visualización, las estructuras 3D se pueden examinar haciendo clic y arrastrando la estructura. Se pueden realizar manipulaciones de la perspectiva y la rotación y traducción de moléculas.
Al intentar este procedimiento es importante recordar hacer coincidir con precisión el contraste de neutrones de los grupos de cabeza y cola del detergente con el disolvente D2O H2O. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para explorar la estructura de las proteasas intramembrana asparto. Estas proteínas están implicadas en la respuesta inmune, hepatitis C y la enfermedad de Alzheimer.
No olvide que trabajar en laboratorios bioquímicos y en instalaciones de haz de neutrones puede ser peligroso. Las precauciones tales como el uso de equipos de protección personal y el cumplimiento de todas las normas de seguridad de las instalaciones y las publicaciones radiológicas son obligatorias al realizar este procedimiento.
