Bu yöntem, integral membran proteinleri ile ilgili anahtar sorulara yardımcı olabilir, örneğin oligomerik durum, boyutları, genel şekli ve çözeltideki düşük çözünürlüklü yapısı gibi. Membran proteinlerinin çözüm çalışmaları deterjan lar gibi moleküllerin dengelenmesini gerektirir. Bu teknik, deterjanları görünmez yapar ve membran proteininden gelen sinyali vurgular avantajına sahiptir.
Bu tekniğin etkileri birçok biyolojik ve tıbbi araştırma sorularına kadar uzanır, çünkü proteinlerin 1/3'ünden fazlası birçok hayati hücresel işlevi yerine getirdikleri zarlarda yer alır. Döteryum etiketleme ve nötron saçılma adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, çok az kurum bu teknikler konusunda eğitim sunduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir. Başlamak için, kontrast değişim verilerinin analizi için modüller olan WEB uygulaması MULCh'ü kullanarak nötron saçılma uzunluğu yoğunluklarını veya SLD'leri belirleyin.
Sol gezinti bölmesinde bulunan kontrastı tıklatarak kontrast modüllerini açın. Proje başlığı için metin sağlayın ve alt birim bir ve alt birim iki olarak iki bileşen için aşağıdaki ayrıntıları girin. Formül metin kutusuna her bileşen için moleküler formül girin.
Daha sonra hacmin altındaki kutudaki her bileşen için birim hacmini kübik angstroms girin. Son olarak, arabellek bileşenleri için ayrıntıları girin. Nötron kontrast hesaplamalarını gerçekleştirmek için gönder'i tıklatın.
Arabellekte d2O herhangi bir yüzdesi bu parametreleri belirlemek için formüller yanı sıra dağılım uzunluğu yoğunluğu ve kontrast maç noktaları bir tablo sağlayan bir sonuç sayfası oluşturulur. Bileşen kontrastı eşleşme noktalarına özellikle dikkat ederek saçılma parametrelerini gözden geçirin. LB orta hedef protein dizisi için indüklanabilir bir ifade vektörü barındıran E.coli hücrelerini 600 nanometre veya Yaklaşık bir OD 600 optik yoğunluğa büyütün.
E.coli hücrelerini, lb kültürünü üç mililitrelik en az orta da 1'den 20'ye seyrelterek, deuterated proteinin aşırı ekspresyonu için ölçeklendirmeden önce döteryum etiketli ortama uyarla. Yaklaşık bir OD 600 büyüdükten sonra, 50, 75 ve% 100 D2O içeren minimal orta kullanarak 20 seyreltme bir tekrarlayın. Bir kez adapte, bir biyoreaktör deuterated hücre kütlesinin verimini artırmak için kültür büyümeye devam.
D2O içeriği arttıkça büyüme oranları azalacaktır. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücreleri hasat, lyse ve arındırmaya devam edin. Sonraki hızlı protein sıvı kromatografi sistemi kullanarak son değişim arabellek iki sütundan daha büyük bir boyut dışlama sütun u dengeleyin.
Numuneyi enjekte ettikten sonra, kolonu ilgi proteinine karşılık gelen izole kesirlerde çalıştırın. Küçük açı nötron saçılımı veya SANS arka plan çıkarma için eşleşen arabellek bir aliquot ayırın. SANS verilerini toplamak için önce örnekleri ve tamponları kuvars hücrelerine yükleyin.
Kiriş deklanşörünü kapattıktan sonra, numune ortamı alanına yaklaşın ve kuvars hücrelerini numune değiştiriciye yerleştirin. Her örnek hücresi için örnek değiştirici konumunu kaydedin. Alanı kontrol edin ve numune çevre alanından ayrılmadan önce Kiriş yolunun tıkanıklıktan arındığından emin olun.
Sonra kiriş deklanşör açın. Otomatik veri toplama için tablo tarar. Nötron saçılma bilim adamı tarafından sağlanan enstrüman operasyonu için talimatları izleyin.
SANS verilerinin 2B görüntüden 1B çizime indirgenmesi için Mantid Plot yazılımını ve Python komut dosyasını kullanın. Bunu yapmak için, uzak çözümleme kümesine giriş yapın ve komut satırından Mantid çizimini çalıştırın. Ardından sağlanan kullanıcı azaltma komut dosyasını açın ve ilgili taramaya niçin ilgili tazyik numaralarını veya tanımlamayı uygun listeye arabellek çiftleri halinde yerleştirin.
Belirtilen konumda dört sütunlu metin dosyası olarak azaltılmış veri oluşturmak için komut dosyasını çalıştırın. Sağ tıklayın uygun çalışma alanı ve Mantid arsa ve saçılma profilleri ilk inceleme için hataları ile arsa seçin. ATSAS yazılım paketini indirin ve veri çizimi, arabellek ölçekleme ve çıkarma ve Guinier analizi için PRIMUS'u kullanın.
ATSAS, SAS veri analizi uygulamasını başlatın ve örnek ve arabellek çiftine karşılık gelen azaltılmış veri dosyalarını yükleyin. Arabelleği düzgün ölçeklendirmek için, her iki profilin de düz olarak benzer olduğu yüksek Q'daki veri aralığını seçin ve işlemler sekmesinin altında bulunan ölçek düğmesini tıklatın. Tüm noktaları görüntülemek için veri aralığını artırın, bu işlemi gerçekleştirmek için çıkarma'yı tıklatın.
SAS veri analizi uygulamasının analiz sekmesini kullanarak arabellek çıkarılan örnek verilerin Guinier analizini gerçekleştirin. Listede uygun dosyanın seçildiğinden emin olun ve girdap yarıçapını tıklatın. Otomatik RG düğmesine tıklayarak guinier uyumu gerçekleştirmek için otomatik bir girişim sağlanacaktır.
Düşük Q verilerinin tümünün dahil olduğu veri aralığını genişletin ve Q maksimum kez RG sınırı 1,3'ün altına inene kadar yüksek Q puanlarını alarak veri aralığını daraltmaya başlayın. Verilerin sığdırmazlık aralığında doğrusal olduğunu doğrulamak için artıkların çizimini kullanın. Sığdırma bölgesinde küçük ayarlamalar yapın ve bu değerlerin uyumda kullanılan veri aralığına karşı duyarlılığını izleyin.
Gnome'daki R'nin olasılık dağılım işlevini elde edin. Şimdi çözümleme sekmesindeki mesafe dağıtım sihirbazını başlatın. Kaliteli bir model elde etmek için verilere iyi bir uyum sağlamak esastır.
Moleküliçindeki maksimum atomlararası mesafe olan Dmax'ı belirleyin. Rmax'ı zorlamak için kutunun işaretlerini açarak Dmax için bir değer tahmin edin sıfıra eşittir ve Dmax için büyük bir değer girin. R'nin P'sinin çizimindeki ilk X kesebu bu tahmine neden olabilir.
Bu Dmax değeri ne kadar veri sayısı için kullanılan veri aralığı nın yanı sıra verilere ve ortaya çıkan R eğrisine uygun gnome'u optimize etmek için kullanılan veri aralığında artımlı değişiklikler yapın. Primus şekil sihirbazını SAS veri analizi nin analiz sekmesindeki dammif düğmesinden başlatın ve el ile parametre seçimini kullanın. Guinier aralığını sığdır'dan tanımlayın ve navigasyon düğmelerini kullanarak bir sonraki adıma geçin.
R çiziminin P'sindeki sığdırma değerlerini tanımlayın ve bir sonraki adıma geçin. ab initio modelleme işlemi için parametreler sağlayın. Ardından commit düğmesini kullanarak işlemi başlatın.
ATSAS içinde supcomb kullanarak ilgili bir yüksek çözünürlüklü model ile son sans zarfı yerve üst üste. Yüksek çözünürlüklü PDB modelinin bir kopyasını çalışma dizinindeki SANS zarfına sığacak şekilde yerleştirin. Daha sonra ilk listelenen şablon yapısı ile iki bağımsız değişken olarak PDB dosya adlarını kullanarak komut satırından supcomb yürütmek.
Son olarak, 3D moleküler grafik görüntüleme programı PyMOL'u kullanarak ab initio model sonuçlarını görselleştirin. SANS zarfı ve yüksek çözünürlüklü yapı üst üste bindikten sonra, bu modeller herhangi bir moleküler grafik görüntüleme programı kullanılarak görselleştirilebilir. PyMOL görselleştirme sürecine genel bir bakış gösterilmiştir.
PYMOL'da PDB yapı dosyaları açıldıktan sonra, modeller PyMOL görüntüleyici penceresinde görünür olmalıdır. Her modelin gösterimleri, her dosya adının yanındaki S düğmesi kullanılarak değiştirilebilir. Burada SANS zarfı için bir yüzey gösterimi ve yüksek çözünürlüklü modelin protein omurgası için bir çizgi film gösterimi kullanılır.
C tuşu altında bulunan seçeneklerarasından uygun bir renk düzeni seçilebilir. Protein zincirleri için, bir chainbow boyama yorumlamaya yardımcı olmak için N'den C terminus bir renk gradyan sağlar. Zarf ın içindeki protein yapısının daha iyi görüntülenmesi için yüzey gösterimine saydamlık uygulanır.
Yayın görselleri için beyaz bir arka plan önerilir. Bu görselleştirme ipuçları uygulandıktan sonra 3B yapılar tıklayarak ve sürükleyerek incelenebilir. Perspektif ve molekül rotasyonu ve çevirisi manipülasyonları yapılabilir.
Bu prosedürü denerken deterjan baş ve kuyruk gruplarının nötron kontrastını D2O H2O çözücü ile doğru bir şekilde eşleştirmeyi unutmamak gerekir. Bu teknik, gelişiminden sonra membran içi asparto proteazların yapısını keşfetmenin yolunu açmıştır. Bu proteinler bağışıklık yanıtı, hepatit C ve Alzheimer hastalığında rol oynarlar.
Biyokimyasal laboratuvarlarda ve nötron ışını tesislerinde çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü uygularken kişisel koruyucu ekipman takmak ve tüm tesis güvenlik kurallarına ve radyolojik ilanlara uymak gibi önlemler zorunludur.
