이 방법은 올리고머 상태, 크기, 전반적인 모양 및 용액의 낮은 해상도 구조와 같은 일체형 막 단백질에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 막 단백질의 솔루션 연구는 세제와 같은 분자를 안정화해야 합니다. 이 기술은 세제를 보이지 않게 하고 막 단백질의 신호를 강조한다는 장점이 있습니다.
단백질의 1/3 이상이 많은 중요한 세포 기능을 능력을 발휘하는 막에 있기 때문에 이 기술의 의미는 많은 생물학 및 의학 연구 질문으로 확장됩니다. 이 방법의 시각적 데모는 중음부 라벨링 및 중성자 산란 단계가 이러한 기술에 대한 교육을 제공하는 기관이 거의 없기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 먼저, 콘트라스트 변형 데이터 분석을 위한 모듈인 웹 애플리케이션 MULCh를 사용하여 중성자 산란 길이 밀도 또는 SD를 결정한다.
왼쪽 탐색 창에 있는 콘트라스트를 클릭하여 콘트라스트 모듈을 엽니다. 프로젝트 제목에 대한 텍스트를 제공하고 두 구성 요소에 대한 세부 정보를 하위 단위 1 및 하위 단위 2로 입력합니다. 수식 텍스트 상자의 각 구성 요소에 대한 분자 수식을 입력합니다.
그런 다음 볼륨 아래 상자에 있는 각 구성 요소에 대한 입방 협전으로 볼륨을 입력합니다. 마지막으로 버퍼 구성 요소에 대한 세부 정보를 입력합니다. 중성자 대비 계산을 수행하려면 제출을 클릭합니다.
분기 길이 밀도 및 콘트라스트 일치 점의 테이블을 제공하고 버퍼에서 지정된 D2O 백분율로 이러한 매개 변수를 결정하는 공식을 제공하는 결과 페이지가 생성됩니다. 부품 대비 일치 점에 특히 주의를 기울여 산란 매개 변수를 검토합니다. LB 배지에서 표적 단백질 서열에 대한 유도식 벡터를 수용하는 E.coli 세포를 약 1의 600 나노미터 또는 OD 600에서 광학 밀도로 키워보도록 한다.
최소 배지의 3밀리리터에서 LB 배양1~20을 희석시킴으로써 중음 단백질의 과잉 발현을 위해 확장하기 전에 E.coli 세포를 중수소에 부착된 배지에 적응한다. 약 1의 OD 600으로 성장한 후, 50, 75 및 100%D2O를 포함하는 최소 배지를 사용하여 1~20개의 희석을 반복한다. 일단 적응되면, 유두된 세포 질량의 수율을 높이기 위하여 생물 반응기에서 문화를 계속 성장합니다.
D2O 함량이 증가함에 따라 성장률이 감소할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 수확, lyse 및 정화합니다. 다음으로 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 최종 교환 버퍼의 두 개 이상의 컬럼 볼륨으로 크기 배제 컬럼을 평형화합니다.
시료를 주입한 후, 관심 있는 단백질에 해당하는 분획을 격리하여 컬럼을 실행한다. 작은 각도 중성자 산란 또는 SANS 배경 뺄셈에 대한 일치하는 버퍼의 알리쿼트를 예약합니다. SANS 데이터를 수집하려면 먼저 샘플과 버퍼를 쿼츠 셀에 로드합니다.
빔 셔터가 닫히도록 한 후 샘플 환경 영역에 접근하여 석영 셀을 샘플 체인저에 배치합니다. 각 샘플 셀에 대한 샘플 체인저 위치를 기록합니다. 시료 환경 영역을 떠나기 전에 영역을 확인하고 빔 경로가 방해가 없는지 확인합니다.
그런 다음 빔 셔터를 엽니다. 자동화된 데이터 수집을 위한 테이블 스캔을 실행합니다. 중성자 산란 과학자가 제공하는 계측기 작동 지침을 따르십시오.
2D 이미지에서 1D 플롯으로 SANS 데이터를 줄이기 위해 Mantid 플롯 소프트웨어 및 파이썬 스크립트를 사용합니다. 이렇게 하려면 원격 분석 클러스터에 로그인하고 명령줄에서 맨티드 플롯을 실행합니다. 그런 다음 제공된 사용자 감소 스크립트를 열고 해당 목록에서 버퍼 쌍으로 샘플에 대한 해당 검사 번호 또는 식별을 배치합니다.
스크립트를 실행하여 지정된 위치에 있는 4개의 열 텍스트 파일로 축소된 데이터를 생성합니다. 적절한 작업 공간과 맨티드 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 분산 프로파일을 초기 검사할 경우 오류가 있는 플롯을 선택합니다. ATSAS 소프트웨어 제품군을 다운로드하고 데이터 플로팅, 버퍼 크기 조정 및 뺄셈 및 Guinier 분석을 위해 PRIMUS를 사용합니다.
ATSAS, SAS 데이터 분석 응용 프로그램을 실행하고 샘플 및 버퍼 쌍에 해당하는 감소된 데이터 파일을 로드합니다. 버퍼를 제대로 확장하려면 두 프로파일이 평평한 수준에서 유사한 높은 Q에서 데이터 범위를 선택하고 작업 탭 아래에 있는 배율 단추를 클릭합니다. 모든 점을 보려면 데이터 범위를 늘리고 빼기를 클릭하여 이 작업을 수행합니다.
SAS 데이터 분석 응용 프로그램의 분석 탭을 사용하여 버퍼 빼기 샘플 데이터의 Guinier 분석을 수행합니다. 목록에서 적절한 파일이 선택되어 있는지 확인하고 gyration 의 반지름을 클릭합니다. 자동 RG 버튼을 클릭하여 Guinier 맞춤을 수행하려는 자동 시도가 제공됩니다.
Q 최대 시간 RG 제한이 1.3 미만일 때까지 높은 Q 포인트를 빼앗아 데이터 범위를 좁히기 시작하는 데 사용되는 데이터 범위를 확장합니다. 잔류 플롯을 사용하여 데이터가 맞춤 범위에서 선형인지 확인합니다. 적합 영역을 조정하고 적합성에 사용되는 데이터 범위에 대한 이러한 값의 민감도를 모니터링합니다.
노메에서 R의 확률 분포 함수 P를 가져옵니다. 이제 분석 탭 내에서 거리 분포 마법사를 시작합니다. 데이터에 잘 맞는 것을 얻는 것은 품질 모델을 얻는 데 필수적입니다.
분자 내의 최대 중원자 거리인 Dmax를 결정합니다. Rmax를 강제로 강제로 상자를 선택 해제하고 Dmax에 대한 큰 값을 입력하여 Dmax값을 추정합니다. R의 P 플롯에서 첫 번째 X 가로채기는 이 추정치를 산출합니다.
이 Dmax 값과 데이터 및 결과 P의 P 곡선에 대한 노임 맞춤을 최적화하는 데 사용되는 포인트 수에 사용되는 데이터 범위를 점진적으로 변경합니다. SAS 데이터 분석의 분석 탭의 dammif 단추에서 PRIMUS 셰이프 마법사를 시작하고 매개 변수의 수동 선택을 사용합니다. Guinier 범위를 적합에서 정의하고 탐색 단추를 사용하여 다음 단계로 진행합니다.
P의 R 플롯에서 맞춤 값을 정의하고 다음 단계로 진행합니다. ab initio 모델링 프로세스에 대한 매개 변수를 제공합니다. 그런 다음 커밋 단추를 사용하여 프로세스를 시작합니다.
ATSAS 내에서 초콤을 사용하여 관련 고해상도 모델로 최종 산 봉투를 오버레이하고 겹쳐 놓습니다. 작업 디렉터리에서 SANS 봉투에 맞게 고해상도 PDB 모델의 복사본을 배치합니다. 그런 다음 먼저 나열된 템플릿 구조가 있는 두 개의 인수로 PDB 파일 이름을 사용하여 명령줄에서 supcomb을 실행합니다.
마지막으로 3D 분자 그래픽 보기 프로그램인 PyMOL을 사용하여 ab initio 모델 결과를 시각화합니다. SANS 봉투와 고해상도 구조가 겹쳐지면 이러한 모델은 분자 그래픽 보기 프로그램을 사용하여 시각화할 수 있습니다. PyMOL 시각화 프로세스에 대한 개요가 표시됩니다.
PyMOL에서 PDB 구조 파일이 열리면 PyMOL 뷰어 창에 모델을 표시해야 합니다. 각 모델의 표현은 각 파일 이름 옆에 있는 S 버튼을 사용하여 변경할 수 있습니다. 여기서 표면 표현은 SANS 봉투에 사용되며 만화 표현은 고해상도 모델의 단백질 중추에 사용됩니다.
C 버튼 아래에서 사용할 수 있는 옵션에서 적합한 색상 구성표를 선택할 수 있습니다. 단백질 체인의 경우 체인보우 착색은 해석을 돕기 위해 N에서 C 종착색으로 색상 그라데이션을 제공합니다. 투명도는 봉투 내의 단백질 구조를 더 잘 시각화할 수 있도록 표면 표현에 적용됩니다.
게시 이미지의 경우 흰색 배경을 권장합니다. 이러한 시각화 큐가 적용되면 구조를 클릭하고 드래그하여 3D 구조를 검사할 수 있습니다. 원근과 분자 회전 및 번역의 조작을 수행 할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 정확하게 D2O H2O 용매와 세제 헤드와 꼬리 그룹의 중성자 대비를 일치하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후,이 기술은 인트라멤브레인 아스파토 프로테아제의 구조를 탐구하기위한 길을 열었습니다. 이 단백질은 면역 반응, C형 간염 및 알츠하이머 병에 관여합니다.
생화학 실험실과 중성자 빔 시설에서 일하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비 착용 및 모든 시설 안전 규칙 및 방사선 게시에 따르는 것과 같은 예방 조치는 필수입니다.
