Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über integrale Membranproteine wie den oligomeren Zustand, ihre Größe, Gesamtform und niedrige Auflösung Struktur in Lösung zu beantworten. Lösungsstudien von Membranproteinen erfordern stabilisierende Moleküle wie Waschmittel. Diese Technik hat den Vorteil, dass sie Waschmittel unsichtbar macht und das Signal des Membranproteins hervorhebt.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf viele biologische und medizinische Forschungsfragen, da über 1/3 der Proteine in Membranen liegen, wo sie viele lebenswichtige zelluläre Funktionen ausführen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Deuterium-Etikettierungs- und Neutronenstreuungsschritte schwer zu erlernen sind, da nur sehr wenige Institutionen Schulungen in diesen Techniken anbieten. Bestimmen Sie zunächst Neutronenstreuungslängendichten oder SLDs mithilfe der Webanwendung MULCh, Modulen zur Analyse von Kontrastvariationsdaten.
Öffnen Sie das Kontrastmodul, indem Sie im linken Navigationsbereich auf Kontrast klicken. Geben Sie Text für einen Projekttitel an, und geben Sie die folgenden Details für zwei Komponenten als Untereinheit eins und Untereinheit zwei ein. Geben Sie die Molekularformel für jede Komponente in das Formeltextfeld ein.
Geben Sie dann das Volumen in kubischen Angstroms für jede Komponente in das Feld unterhalb des Volumens ein. Geben Sie schließlich die Details für Pufferkomponenten ein. Klicken Sie auf Senden, um die Neutronenkontrastberechnungen durchzuführen.
Es wird eine Ergebnisseite generiert, die eine Tabelle mit Streulängendichte und Kontrastübereinstimmungspunkten sowie Formeln zum Bestimmen dieser Parameter zu einem beliebigen Prozentsatz von D2O im Puffer bereitstellt. Überprüfen Sie die Streuparameter unter besonderer Berücksichtigung der Übereinstimmungspunkte des Komponentenkontrasts. Wachsen Sie E.coli-Zellen, die einen induzierbaren Expressionsvektor für die Zielproteinsequenz im LB-Medium auf eine optische Dichte von 600 Nanometern oder OD 600 von etwa einem enthalten.
Passen Sie E.coli-Zellen an Deuterium-markiertes Medium an, bevor Sie sich für die Überexpression eines deuterated Proteins vergrößern, indem Sie die LB-Kultur ein bis 20 in drei Milliliter neines Mediums verdünnen. Nach dem Wachstum auf eine OD 600 von etwa einem, wiederholen Sie die ein bis 20 Verdünnungen mit minimalen Medium mit 50, 75 und 100%D2O. Nach der Anpassung, weiter die Kultur in einem Bioreaktor wachsen, um die Ausbeute der deuterated Zellmasse zu erhöhen.
Wenn der D2O-Gehalt erhöht wird, werden die Wachstumsraten sinken. Fahren Sie mit der Ernte, Lyse und Reinigung der Zellen fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes gleicht eine Größenausschlussspalte mit mehr als zwei Spaltenvolumina des endgültigen Austauschpuffers mithilfe eines schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystems aus.
Führen Sie die Säule nach der Injektion der Probe in Isolatfraktionen aus, die dem Protein von Interesse entsprechen. Reservieren Sie ein Aliquot des übereinstimmenden Puffers für die Kleinwinkel-Neutronenstreuung oder SANS-Hintergrundsubtraktion. Um SANS-Daten zu sammeln, laden Sie zunächst Proben und Puffer in Quarzzellen.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass der Balkenverschluss geschlossen ist, nähern Sie sich dem Probenumgebungsbereich und legen Sie die Quarzzellen in den Probenwechsler. Zeichnen Sie die Position des Probenwechslers für jede Beispielzelle auf. Überprüfen Sie den Bereich, und stellen Sie sicher, dass der Balkenweg frei von Hindernissen ist, bevor Sie den Probenumgebungsbereich verlassen.
Öffnen Sie dann den Balkenverschluss. Führen Sie einen Tabellenscan für die automatisierte Datenerfassung aus. Befolgen Sie die Anweisungen für den Instrumentenbetrieb des Neutronenstreuers.
Verwenden Sie Mantid Plot-Software und Python-Skript für die Reduzierung von SANS-Daten von einem 2D-Bild auf ein 1D-Plot. Melden Sie sich dazu beim Remoteanalysecluster an und führen Sie das Mantid-Plot über die Befehlszeile aus. Öffnen Sie dann das bereitgestellte Benutzerreduktionsskript und platzieren Sie die entsprechenden Scannummern oder Identifikationen für die Probe in Pufferpaaren in der entsprechenden Liste.
Führen Sie das Skript aus, um reduzierte Daten als vierspaltende Textdatei am angegebenen Speicherort zu generieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den entsprechenden Arbeitsbereich und das Mantid-Plot und wählen Sie das Diagramm mit Fehlern für eine erste Untersuchung der Streuprofile aus. Laden Sie die ATSAS-Software-Suite herunter und verwenden Sie PRIMUS für Datenplotierung, Pufferskalierung und Subtraktion sowie Guinier-Analyse.
Starten Sie die ATSAS-, SAS-Datenanalyseanwendung und laden Sie die reduzierten Datendateien, die dem Beispiel- und Pufferpaar entsprechen. Um den Puffer richtig zu skalieren, wählen Sie den Datenbereich bei hoch Q aus, in dem beide Profile in flacher Ebene ähnlich sind, und klicken Sie auf die Skalierungsschaltfläche unter der Registerkarte Operationen. Erhöhen Sie den Datenbereich, um alle Punkte anzuzeigen, klicken Sie auf Subtrahieren, um diesen Vorgang auszuführen.
Führen Sie eine Guinier-Analyse der puffersubtrahierten Beispieldaten mithilfe der Registerkarte Analyse der SAS-Datenanalyseanwendung durch. Stellen Sie sicher, dass die richtige Datei in der Liste ausgewählt ist, und klicken Sie auf den Kreiselradius. Ein automatisierter Versuch, eine Guinier-Passung durchzuführen, wird durch Klicken auf die Auto RG-Schaltfläche bereitgestellt.
Erweitern Sie den Datenbereich, der verwendet wird, um alle niedrigen Q-Daten einzubeziehen, und beginnen Sie mit der Eingrenzung des Datenbereichs, indem Sie hohe Q-Punkte wegnehmen, bis die Q-maximale RG-Grenze unter 1,3 liegt. Verwenden Sie das Diagramm der Residuen, um zu überprüfen, ob die Daten im Anpassungsbereich linear sind. Nehmen Sie kleine Anpassungen am Anpassungsbereich vor, und überwachen Sie die Empfindlichkeit dieser Werte für den in der Anpassung verwendeten Datenbereich.
Erhalten Sie die Wahrscheinlichkeitsverteilungsfunktion P von R in gnome. Starten Sie nun den Entfernungsverteilungs-Assistenten auf der Registerkarte Analyse. Eine gute Anpassung an die Daten ist für die Erzielung eines Qualitätsmodells unerlässlich.
Bestimmen Sie Dmax, den maximalen interatomaren Abstand innerhalb des Moleküls. Schätzen Sie einen Wert für Dmax, indem Sie das Kontrollkästchen deaktivieren, um Rmax zu erzwingen, gleich Null, und einen großen Wert für Dmax eingeben. Das erste X-Abfangen im Plot von P von R ergibt diese Schätzung.
Nehmen Sie inkrementelle Änderungen an diesem Dmax-Wert sowie den Datenbereich vor, der für die Anzahl der Punkte verwendet wird, die verwendet werden, um die Gnome-Anpassung an die Daten und die resultierende P-Kurve der R-Kurve zu optimieren. Starten Sie den PRIMUS-Shape-Assistenten über die Dammif-Schaltfläche auf der Registerkarte Analyse der SAS-Datenanalyse, und verwenden Sie eine manuelle Auswahl von Parametern. Definieren Sie den Guinier-Bereich von der Passung und fahren Sie mit den Navigationsschaltflächen zum nächsten Schritt fort.
Definieren Sie Anpassungswerte aus dem P-Plot von R, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Geben Sie Parameter für den ab initio Modellierungsprozess an. Starten Sie dann den Prozess mit der Commit-Schaltfläche.
Überlagern und überlagern Sie den endgültigen Sans-Umschlag mit einem zugehörigen hochauflösenden Modell, das Supcomb in ATSAS verwendet. Platzieren Sie eine Kopie des heuschlösen PDB-Modells, um an den SANS-Umschlag im Arbeitsverzeichnis anzupassen. Führen Sie dann supcomb von der Befehlszeile aus mit den PDB-Dateinamen als zwei Argumente mit der zuerst aufgeführten Vorlagenstruktur aus.
Schließlich visualisieren Sie die Ergebnisse des ab initio-Modells mit PyMOL, einem 3D-Molekulargrafik-Anzeigeprogramm. Sobald der SANS-Umschlag und die hochauflösende Struktur überlagert wurden, können diese Modelle mit jedem molekularen Grafikanzeigeprogramm visualisiert werden. Eine Übersicht über den PyMOL-Visualisierungsprozess wird angezeigt.
Sobald die PDB-Strukturdateien in PyMOL geöffnet wurden, sollten die Modelle im PyMOL-Viewer-Fenster sichtbar sein. Die Darstellungen jedes Modells können über die S-Schaltfläche neben jedem Dateinamen geändert werden. Hier wird eine Oberflächendarstellung für den SANS-Umschlag und eine Cartoon-Darstellung für das Protein-Backbone des hochauflösenden Modells verwendet.
Aus den unter der C-Taste verfügbaren Optionen kann ein passendes Farbschema ausgewählt werden. Für Proteinketten bietet eine Kettenbogenfärbung einen Farbverlauf von N nach C Endstation, um die Interpretation zu unterstützen. Transparenz wird auf die Oberflächendarstellung angewendet, um eine bessere Visualisierung der Proteinstruktur innerhalb der Hülle zu ermöglichen.
Für Publikationsbilder wird ein weißer Hintergrund empfohlen. Sobald diese Visualisierungshinweise angewendet wurden, können die 3D-Strukturen durch Anklicken und Ziehen der Struktur untersucht werden. Manipulationen der perspektivischen und Molekülrotation und -übersetzung können durchgeführt werden.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, den Neutronenkontrast der Waschmittelkopf- und Schwanzgruppen genau mit dem D2O H2O Lösungsmittel abzugleichen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Erforschung der Struktur der Intramembran-Asparto-Proteasen. Diese Proteine sind an der Immunantwort, Hepatitis C und Alzheimer-Krankheit beteiligt.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit in biochemischen Laboratorien und in Neutronenstrahlanlagen gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und die Befolgung aller Sicherheitsvorschriften und radiologischen Entsendungen sind bei der Durchführung dieses Verfahrens obligatorisch.
