Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области доставки лекарств, такие как целевая доставка терапевтических средств для рака человека и плаценты цистобласт. Основным преимуществом этой техники является то, что это простой и воспроизводимый метод синтеза пептидов, спрягаемых в других частицах. Для начала добавьте три миллиметра четырехпроцентного этанола в стерильную 10-миллилитровую центрифугу.
Затем добавьте 90 микрограммов раствора соевого лецитина, 210 микрограммов раствора DSPE-PEG-карбоксилиновой кислоты и 750 микрограммов раствора doX. Используйте один миллилитр шприц для пипетки два миллиграмма PLGA фондовый раствор. Поместите центрифугу трубку в ледяную ванну на ультразвуковой процессор и sonicate в течение двух минут.
Затем добавьте раствор PLGA в центрифугу. Для очистки ДНК используйте центрифугный фильтр для мытья раствора в буфере МПС 0,1. Затем центрифуга раствора при 1000 Г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.
Чтобы начать активацию эстера, добавьте 0,4 миллиграмма EDC к одному миллилитру ДНК. Затем добавьте к реакции 0,24 миллиграмма ГСЗ. Затем позвольте реакции происходить в течение одного часа при комнатной температуре в темноте.
После этого тщательно перемешайте компоненты реакции и поместите реакцию на шейкер. Чтобы начать реакцию амина, используйте PBS для увеличения буферного рН с 7,2 до 7,5. Затем добавьте 0,5 миллиграмма пептида pICSA, нацеленного на реакционной раствор.
Хорошо смешайте раствор и поместите его на шейкер. Затем, позвольте реакции продолжаться при четырех градусах по Цельсию в ночное время в темноте. На следующий день заполните диализные мешки конъюгативной раствором.
Очистить PICSA DNPs с буфером PBS при комнатной температуре в течение 24 часов в темноте. После культивирования клеток в соответствии с текстовым протоколом, удалить средства массовой информации и добавить один миллилитр свежих, холодных средств массовой информации с пятью процентами FBS и pICSA DNPs или DNPs. Затем инкубировать клетки и наночастицы смеси в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию.
После этого, удалить средства массовой информации и мыть клетки три раза с PBS. Затем добавьте один миллилитр свежих средств массовой информации и инкубировать клетки в течение 30 минут при 37 градусах цельсия. После этого, удалить средства массовой информации и мыть клетки три раза с PBS.
Затем добавьте два миллилитров холодного, четыре процента PFA и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 10 минут. Удалите PFA и мыть клетки с двумя миллилитров PBS. Затем добавьте один миллилитр PBS с DAPI для окрашивания ядер.
Разрешить смесь инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Наконец, добавьте монтажную среду и изображение флуоресценции с помощью флуоресцентной микроскопа. Используя этот протокол, ДНК были успешно подготовлены и спряжены для pICSA BP. После спряжения диаметр первичных ДНК увеличился примерно до 109 нанометров.
Изображения TEM DNPs и PICSA DNPs показали, что частицы были хорошо рассеяны и в целом продемонстрировали сферическую морфологию. Потенциал зеты наночастиц был отрицательным 20,1 и 29,9 милливольт, что свидетельствует о том, что наночастицы были очень стабильными. Анализ клеточного поглощения JEG3 показал pICSA DNPs, связанные с клетками JEG3 в течение 30 минут.
Таким образом, pICSA BP был эффективно конъюгированных на поверхность. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы sonicate смесь в течение одной-двух минут, прежде чем добавлять PLGA. Следуя этой процедуре, наши методы, такие как анализ HPLC, могут быть выполнены для того, чтобы более точно определить эффективность спряжения.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области репродуктивной биологии, чтобы изучить возможность плаценты ориентации лечения осложнений беременности.
