Bu yöntem ilaç dağıtım alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, insan kanserleri ve plasenta sistoblast için terapötik hedefli teslim gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, diğer parçacıklarda konjuge peptidler sentezlemek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem olmasıdır. Başlamak için, steril bir 10 mililitresantrifüj tüp için yüzde dört etanol üç milimetre ekleyin.
Daha sonra, 90 mikrogram soya lesitin stok çözeltisi, 210 mikrogram DSPE-PEG-karboksilik asit çözeltisi ve 750 mikrogram DOX stok çözeltisi ekleyin. Plga stok çözeltisi iki miligram pipet için bir mililitreşşü kullanın. Bir ultrasonik işlemci ve sonicate iki dakika için bir buz banyosu nda santrifüj tüp yerleştirin.
Sonra, santrifüj tüp içine PLGA stok çözeltisi damla-bilge ekleyin. DNP'leri arındırmak için çözeltiyi 0,1 molar MES arabelleğinde yıkamak için bir santrifüj filtresi kullanın. Daha sonra çözeltiyi 1000 G'de dört santigrat derecede üç dakika santrifüj edin.
Ester aktivasyonuna başlamak için, bir mililitre DNP'ye 0,4 miligram EDC ekleyin. Sonra, reaksiyona 0.24 miligram NHS ekleyin. Daha sonra, reaksiyonkaranlıkta oda sıcaklığında bir saat kadar gerçekleşmesine izin verin.
Bundan sonra reaksiyon bileşenlerini iyice karıştırın ve reaksiyonu bir çalkalayıcının üzerine yerleştirin. Amin reaksiyonu başlatmak için, tampon pH'ı 7,2'den 7,5'e çıkarmak için PBS kullanın. Daha sonra, reaksiyon çözeltisine peptidi hedefleyen 0,5 miligram pICSA ekleyin.
Çözeltiyi iyice karıştırın ve bir çalkalayıcıüzerine yerleştirin. Daha sonra, reaksiyonun karanlıkta bir gecede dört derece santigrat derecede devam etmesine izin verin. Ertesi gün, eşleç çözeltisi ile diyaliz torbaları doldurun.
PICSA DNP'leri pBS tamponu ile oda sıcaklığında 24 saat karanlıkta arındırın. Metin protokolüne göre hücreleri kültüre aldıktan sonra, ortamı kaldırın ve yüzde beş FBS ve pICSA DNPs veya DNPs ile bir mililitre taze, soğuk ortam ekleyin. Sonra, hücre ve nano-parçacık karışımını dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Sonra, taze medya bir mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece 30 dakika boyunca hücreleri kuluçka. Bundan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
Daha sonra, soğuk iki mililitre ekleyin, dört yüzde PFA ve 10 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçka. PfA çıkarın ve PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra, çekirdek boyama için DAPI ile PBS bir mililitre ekleyin.
Karışımın oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. Son olarak, montaj ortamı ekleyin ve floresan mikroskobu ile floresan görüntü. Bu protokol kullanılarak, DNP'ler başarıyla hazırlandı ve pICSA BP'ye konjuge edildi. Konjugasyondan sonra primer DNP'lerin çapı yaklaşık 109 nanometreye yükseldi.
DNP'lerin ve pICSA DNP'lerin TEM görüntüleri parçacıkların iyi dağıldığını ve genellikle küresel morfolojiyi gösterdiğini göstermiştir. Nano parçacıkların zeta potansiyeli negatif 20.1 ve 29.9 milivolt, nano-parçacıklar son derece kararlı olduğunu gösteren. JEG3 hücresel alım skalası, 30 dakika içinde JEG3 hücrelerine bağlı pICSA DNP'leri gösterdi.
Bu nedenle, pICSA BP verimli yüzeye konjuge edildi. Bu yordamı çalışırken, PLGA eklemeden önce bir ila iki dakika boyunca karışımı sonicate hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, konjugasyon verimliliğini daha doğru belirlemek için HPLC testi gibi yöntemlerimiz gerçekleştirilebilir.
Bu teknik, gelişiminden sonra üreme biyolojisi alanında araştırmacıların gebelik komplikasyonlarında plasenta hedeflemesi olasılığını keşfetmelerinin önünü açmıştır.
