Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como la administración dirigida de terapias a cánceres humanos y el cistoblast de placenta. La principal ventaja de esta técnica es que es un método simple y reproducible para sintetizar péptidos conjugados en otras partículas. Para empezar, agregue tres milímetros de cuatro por ciento de etanol a un tubo estéril de centrífuga de 10 mililitros.
A continuación, añadir 90 microgramos de solución de stock de lecitina de soja, 210 microgramos de solución de stock de ácido DSPE-PEG-carboxílico, y 750 microgramos de solución de stock DOX. Utilice una jeringa de un mililitro para pipetear dos miligramos de solución de material PLGA. Coloque el tubo centrífugo en un baño de hielo en un procesador ultrasónico y sonicar durante dos minutos.
A continuación, añada la solución de material PLGA en el tubo de centrífuga. Para purificar los DSP, utilice un filtro de centrífuga para lavar la solución en el búfer MES molar 0.1. Luego, centrifugar la solución a 1000 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.
Para comenzar la activación del éster, agregue 0.4 miligramos de EDC a un mililitro de DNP. A continuación, agregue 0,24 miligramos de NHS a la reacción. Luego, permita que la reacción ocurra hasta una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
Después de esto, mezcle los componentes de reacción a fondo y coloque la reacción en una coctelera. Para iniciar la reacción de la amina, utilice PBS para aumentar el pH del tampón de 7.2 a 7.5. A continuación, añadir 0,5 miligramos de péptido de orientación pICSA a la solución de reacción.
Mezcle bien la solución y colóquela en una coctelera. Luego, permita que la reacción continúe a cuatro grados centígrados durante la noche en la oscuridad. Al día siguiente, llene las bolsas de diálisis con la solución conjugada.
Purifique los DSP pICSA con el tampón PBS a temperatura ambiente durante 24 horas en la oscuridad. Después de cultivar las células de acuerdo con el protocolo de texto, quite los medios y agregue un mililitro de medios frescos y fríos con el cinco por ciento de los DSP o DNP del pICSA. Luego, incubar la mezcla celular y nanopartícula durante una hora a cuatro grados Centígrados.
Después de esto, retire el medio y lave las células tres veces con PBS. Luego, agregue un mililitro de medios frescos e incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de esto, retire el medio y lave las células tres veces con PBS.
Luego, agregue dos mililitros de frío, cuatro por ciento de PFA e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retire la PFA y lave las células con dos mililitros de PBS. A continuación, agregue un mililitro de PBS con DAPI para la tinción de núcleos.
Dejar incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Por último, añada el medio de montaje y la imagen de la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia. Usando este protocolo, los DNP fueron preparados y conjugados con éxito con pICSA BP. Después de la conjugación, el diámetro de los DSP primarios aumentó a aproximadamente 109 nanómetros.
Las imágenes TEM de los DSP y los DNPs pICSA mostraron que las partículas estaban bien dispersas y generalmente demostradas morfología esférica. El potencial zeta de las nanopartículas fue negativo 20,1 y 29,9 milivoltios, lo que indica que las nanopartículas eran altamente estables. El ensayo de absorción celular JEG3 indicó los DSP pICSA enlazados a las células JEG3 en un plazo de 30 minutos.
Por lo tanto, el pICSA BP se conjugaba eficientemente a la superficie. Al intentar este procedimiento, es importante recordar sonicar la mezcla durante uno o dos minutos antes de agregar PLGA. Siguiendo este procedimiento, nuestros métodos como el ensayo HPLC se pueden realizar con el fin de determinar la eficiencia de conjugación con mayor precisión.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología reproductiva exploraran la posibilidad de tratamiento dirigido a la placenta en complicaciones del embarazo.
