이 방법은 인간 암과 태반 낭포블라스트에 대한 치료 대상 전달과 같은 약물 전달 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 입자에 컨쥬게이트된 펩타이드를 합성하는 간단하고 재현 가능한 방법이라는 것입니다. 시작하려면 멸균 10 밀리리터 원심분리기 튜브에 4%의 에탄올3밀리미터를 추가합니다.
그런 다음 대두 레시틴 스톡 솔루션 90마이크로그램, DSPE-PEG-carboxylic acid 스톡 솔루션 210마이크로그램, DOX 재고 용액 750마이크로그램을 추가합니다. PLGA 스톡 솔루션 2밀리그램을 피펫에 1밀리리터 주사기를 사용하십시오. 원심분리기 튜브를 얼음 욕조에 놓고 초음파 프로세서에 놓고 2분 동안 초음파 처리합니다.
그런 다음 PLGA 스톡 솔루션을 원심분리기 튜브에 드롭 와이즈로 추가합니다. DNP를 정화하려면 원심분리기 필터를 사용하여 0.1 어금니 MES 버퍼로 용액을 세척합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 3분 동안 1000G의 원심분리합니다.
에스테르 활성화를 시작하려면 0.4 밀리그램의 EDC를 DNP 1밀리리터에 추가하십시오. 그런 다음 반응에 NHS의 0.24 밀리그램을 추가합니다. 그런 다음, 어두운 실온에서 최대 1 시간 동안 반응이 발생하도록 허용하십시오.
그 후 반응 성분을 철저히 섞어 셰이커에 반응합니다. 아민 반응을 시작하려면 PBS를 사용하여 완충pH를 7.2에서 7.5로 늘립니다. 그런 다음, 반응 용액에 펩티드를 대상으로 하는 pICSA의 0.5 밀리그램을 추가한다.
솔루션을 잘 섞고 셰이커에 놓습니다. 그런 다음, 어둠 속에서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 반응을 진행할 수 있습니다. 다음 날, 컨쥬게이트 용액으로 투석 가방을 채웁니다.
어두운 상황에서 24시간 동안 실온에서 PBS 버퍼로 pICSA DNP를 정화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 배양한 후 미디어를 제거하고 5%의 FBS 및 pICSA DNP 또는 DNP로 신선하고 차가운 미디어의 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 세포와 나노 입자 혼합물을 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.
그 후, 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 세 번 세척한다. 그런 다음 신선한 매체의 1 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 그 후, 미디어를 제거하고 PBS로 세포를 세 번 세척한다.
그런 다음 2 밀리리터의 차가운 PFA를 추가하고 실온에서 10 분 동안 혼합물을 배양합니다. PFA를 제거하고 PBS의 두 밀리리터로 세포를 세척. 그런 다음 핵 염색을 위해 DAPI를 통해 PBS 의 1 밀리리터를 추가합니다.
혼합물이 실온에서 10 분 동안 배양하도록 허용하십시오. 마지막으로, 형광 현미경으로 형광을 장착 배지와 이미지를 추가합니다. 이 프로토콜을 사용하여 DNP는 성공적으로 pICSA BP에 준비되고 공주되었습니다. 컨쥬게이션 후, 1차 DNPs의 직경은 약 109나노미터로 증가했습니다.
DNP및 pICSA DNP의 TEM 이미지는 입자가 잘 분산되고 일반적으로 구형 형태를 입증했다는 것을 보여주었습니다. 나노 입자의 제타 전위는 음수 20.1 및 29.9 밀리볼트였으며, 이는 나노 입자가 매우 안정적이었다는 것을 나타낸다. JEG3 세포 조리 분석은 30분 이내에 JEG3 세포에 결합된 pICSA DNP를 나타냈다.
따라서, pICSA BP는 표면으로 효율적으로 공주되었다. 이 절차를 시도하는 동안 PLGA를 추가하기 전에 혼합물을 1 ~ 2 분 동안 초음파 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 HPLC 분석과 같은 방법은 컨쥬게이션 효율을 보다 정확하게 결정하기 위해 수행 될 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 생식 생물학 분야의 연구원들이 임신 합병증에서 태반 표적 치료의 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
