Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della somministrazione di farmaci, come la somministrazione mirata di terapie ai tumori umani e il citoblasto della placenta. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è un metodo semplice e riproducibile per sintetizzare peptidi coniugati in altre particelle. Per iniziare, aggiungere tre millimetri di etanolo al quattro per cento di etanolo a un tubo di centrifuga sterile da 10 millilitri.
Quindi, aggiungere 90 microgrammi di soluzione stock di lecitina di soia, 210 microgrammi di soluzione di stock di acido DSPE-PEG-carbossilico e 750 microgrammi di soluzione stock DOX. Utilizzare una siringa millilitro per pipettare due milligrammi di soluzione stock PLGA. Posizionare il tubo di centrifuga in un bagno di ghiaccio su un processore ad ultrasuoni e sonicare per due minuti.
Quindi, aggiungere la soluzione stock PLGA per quanto riguarda la caduta nel tubo di centrifuga. Per purificare i DNP, utilizzare un filtro di centrifuga per lavare la soluzione in tampone MES molare 0.1. Quindi, centrifugare la soluzione a 1000 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.
Per iniziare l'attivazione dell'estere, aggiungere 0,4 milligrammi di EDC a un millilitro di DNP. Quindi, aggiungere 0,24 milligrammi di NHS alla reazione. Quindi, consentire alla reazione di verificarsi fino a un'ora a temperatura ambiente al buio.
Successivamente, mescolare accuratamente i componenti di reazione e posizionare la reazione su uno shaker. Per iniziare la reazione dell'ammina, utilizzare PBS per aumentare il pH tampone da 7,2 a 7,5. Quindi, aggiungere 0,5 milligrammi di peptide di targeting pICSA alla soluzione di reazione.
Mescolare bene la soluzione e posizionarla su uno shaker. Quindi, consentire alla reazione di procedere a quattro gradi Celsius durante la notte al buio. Il giorno dopo, riempire i sacchetti di dialisi con la soluzione coniugata.
Purificare i DNP pICSA con tampone PBS a temperatura ambiente per 24 ore al buio. Dopo aver coltivato le cellule in base al protocollo di testo, rimuovere il supporto e aggiungere un millilitro di supporti freschi e freddi con il cinque percento di DNP o DNP FBS e pICSA. Quindi, incubare la miscela cellulare e nanoparticelle per un'ora a quattro gradi Celsius.
Successivamente, rimuovere il supporto e lavare le celle tre volte con PBS. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzi freschi e incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il supporto e lavare le celle tre volte con PBS.
Quindi, aggiungere due millilitri di PFA freddo e quattro percento e incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il PFA e lavare le celle con due millilitri di PBS. Quindi, aggiungere un millilitro di PBS con DAPI per la colorazione dei nuclei.
Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti. Infine, aggiungere il supporto di montaggio e l'immagine della fluorescenza con un microscopio a fluorescenza. Utilizzando questo protocollo, i DNP sono stati preparati con successo e coniugati a pICSA BP. Dopo la coniugazione, il diametro dei DNP primari aumentò a circa 109 nanometri.
Le immagini TEM dei DNP e dei DNP pICSA mostravano che le particelle erano ben disperse e generalmente dimostravano morfologia sferica. Il potenziale zeta delle nanoparticelle era negativo 20,1 e 29,9 millivolt, indicando che le nanoparticelle erano altamente stabili. Il saggio di assorbimento cellulare JEG3 ha indicato i DNP pICSA legati alle cellule JEG3 entro 30 minuti.
Pertanto, il pICSA BP è stato coniugato in modo efficiente alla superficie. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di sonicare la miscela per uno o due minuti prima di aggiungere PLGA. Seguendo questa procedura, i nostri metodi come il test HPLC possono essere eseguiti al fine di determinare l'efficienza coniugazione in modo più accurato.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia riproduttiva per esplorare la possibilità di un trattamento mirato alla placenta nelle complicanze della gravidanza.
