שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה על מנגנוני חסינות אישית, כשל חיסוני, סובלנות מרכזית, ו involution התימוס. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הקלטה אורך vivo של גיוס אב ואגרסיה בוגרת של תאי T בתוך מקטעי התימוס של העכבר כלי דם מושתלים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה על ההתפתחות והתפקוד של התימוס, ניתן להחיל גם על רקמות אחרות כגון איים בלבלב או גלומרולי כליות.
כדי לבודד את התימוס, מניחים את העכבר על מגבות נייר סטריליות סופגות בתמונת הגב זקוף במכסה המנוע לזרימה למינארית ומרססים ומנגבים את בטן העכבר עם 70% אתנול. בצע חתך שטחי בצורת V בבטן התחתונה כדי לחשוף את חלל בית החזה ולהשתמש בזוג מספריים ישרים של 10 ס"מ כדי לבצע חתך של 0.5 עד סנטימטר בחזה לאורך קו האמצע הגחוני. מקפלים את העור על כל צד של החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה ולעשות שני חתכים נוספים עמוקים יותר 0.5 עד סנטימטר צדדי דרך הסרעפת וכלוב הצלעות כדי לגשת mediastinum מעולה בחלל בית החזה לפני.
התימוס צריך להופיע כשתי אונות חיוורות ממש מעל הלב. מניחים קצות כף מעוקל מתחת התימוס ולמשוך אנכית כדי לחלץ את האיבר המלא, מניעת מתקפל האחורי של בית החזה עם זוג מדפים ישר. ואז להטביע את התימוס המבודד בצלחת סטרילית 60 מיליליטר המכיל PBS סטרילי קר על קרח ולהשתמש אזמל לחתוך את isthmus החיבור להפריד את האונות התימית.
לפני ההשתלה, תיייגו ושקלו כל עכבר נמען והמקמו את החיה הראשונה בתמקום צדדית צדדית עם עין אחת החשופה ישירות לעדשה של מיקרוסקופ ניתוח. באמצעות מספריים Vannas, בלו אחת האונות התימית מבודדת עד מילימטר אחד ברוחב בעקבות דפוס זיגזג כדי להבטיח כי כל קטע מכיל כמה קליפת המוח התימית רקמת medulla. זה קריטי לקצץ את התימוס ממש לפני ההשתלה כמו חתיכות גדולות לא יכול חריטה כראוי.
לאחר מכן, החל בבסיס הקרנית של האזור הכירורגי, להשתמש בקצה של מחט 40 מילימטר 18-מד כדי להפוך חתך קטן לתוך שכבות קרנית חיצונית, כך קצה של זוג מספריים לנתח ניתן להציג. השתמש במספריים כדי לבצע חתך אגף של חמישה עד 10 מילימטרים ישירות סביב בסיס הקרנית תוך שימוש בממטרים שטוחים כדי להחזיק בחוזקה את הקרנית פתוחה כדי למנוע חתך מחדש. אוחזים באפיתל הקרנית החתך עם המדפים השטוחים, שומרים על הפתח בקרנית תוך החדרת קטע תימין דרך הפתח.
חשוב להכניס את חתיכת התימוס במהירות דרך פתח הקרנית כדי למנוע ניתוח מחדש ספונטני לפני הרקמה של הציג. היזהר לשמור על שלמות הרקמות בשלב זה. לחץ בעדינות על משטח העין כדי להחליק את קטע הרקמה שהוצג למיקום בצד השני ביחס לתלמיד כדי לשמר את תפקוד העין.
ולהשתמש במקלחים שטוחים כדי ללחוץ על שני צידי פתח הקרנית בחוזקה אחד נגד השני במשך שלוש עד חמש שניות כדי לקדם איטום עצמי. אם ההשתלה תבוצע בשתי העיניים, סובבו את העכבר לצד הצדדי הנגדי להשתלה שנייה כפי שהודגם זה הרגע. לאחר השלמת הניתוח, החזירו את העכבר לכלוב ריק מחומם מראש עם מנורת חום עם ניטור עד לחזרה מלאה.
בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, מניחים עכבר נמען הרדמה על פלטפורמת מיקרוסקופ בשלב קבוע בתמקמה צדדית צדדית על כרית חום עם עין אחת פונה כלפי מעלה. ולהכניס את ראש העכבר למחזיק ראש סטריאטוקסי. כוונן את הידית כדי לרסן את ראש העכבר בתצורת הצד הצדדית כדי לאפשר גישה ישירה של מטרת המיקרוסקופ לעין המחזיקה את שתל התימוס ולמשוך לאחור את העפעפיים תוך החזקת העין בשולי הקרנית עם זוג קצות פינצטה מכוסים בצינור פוליאתילן המחובר למפרק אוניברסלי מוצק UST-2.
מוסיפים כמה טיפות של תמיסת מלח סטרילית או קרעים מלאכותיים בין הקרנית לעדשה לפני הנחת מטרת המיקרוסקופ 5X על עין העכבר ולאתר את התימוס בשדה המיקרוסקופ. לאחר מכן עבור למטרת טבילת מים ברזולוציה גבוהה יותר עם מרחק עבודה ארוך ובחר את מצב הרכישה בתוכנת המיקרוסקופ. הפעל את מצב סורק תהודה ובחר במצב דימות XYZT.
הפעל את לייזר ארגון ולהתאים את הכוח ל 30% עבור גירוי פלואורסצנטי. בחר קו לייזר גירוי מתאים ולהגדיר את בקרת מפצל קרן acousto-אופטי עבור אורכי גל פליטה המתאימים באמצעות זיהוי השתקפות בו זמנית כדי לזהות backscatter ולתווה מבנה רקמות. אסוף את הפליטה באורך הגל שנבחר והגדר רזולוציה של 512 על 512 פיקסלים.
לאחר מכן לחץ על בשידור חי כדי להתחיל את ההדמיה, התאמת רמות הרווח לפי הצורך. התמקד בחלק העליון של השתל התימי ובחר להתחיל להגדיר את תחילת מחסנית Z. לאחר מכן התמקדו במישור האחרון בתימוס המושתל שניתן לדמיין ולבחור קצה כדי להגדיר את קצה מחסנית Z באמצעות גודל Z-צעד של חמישה מיקרומטרים.
הגדר את מרווח הזמן לרכישת כל מחסנית Z למשך 1.5 עד שתי שניות ובחר באפשרות רכישה עד להפסקה להדמיה רציפה. לאחר מכן לחץ על התחל לאתחל את ההקלטה. כאן, תמונות שדה בהיר פלואורסצנטי של אותו אזור של שתל התימוס שעשוי לשמש מעקב מקרוסקופי כפול של צמיחת רקמות, involution ומחקרי המשך מוצגים.
התמונה השדה הבהיר גם מקלה על הדמיה של כלי הדם של הרקמה המושתלת, ומאפשרת את המחקר הייחודי של התלות של פיזיולוגיית התימוס באספקת הדם לאורך זמן. מודל זה מאפשר הדמיה של גלגול תאים מבול הדם לתוך התימוס המושתל, מעקב אחר המגעים בין תאי הצאצאים החיוביים של GFP הנכנסים לשתל התימי עם תאי אפיתל וסטרומליים תושבים בעלי תווית RFP במהלך תהליכי בידול ובחירה, כמו גם ניטור של תאי החיסון האלקטרוניים מהתימוס לכלי דם היקפיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את החשיפה לרקמות עבור חריטה אופטימלית וגם להגביל את גודל החתך בעין כדי לאפשר כריתת שבר ללא פגע דרך הקרנית תוך הפחתת פיברוזיס במהלך הריפוי.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טיפולי בקרה מקומיים וחתך של רקמות אחרות לתוך העין ההמולתית כדי לענות על שאלות נוספות על תפקוד לקוי של מערכת החיסון הקשורות לזיהומים, גורמים נוגדי נדיפה ומנגנוני סובלנות להשתלה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את התפתחות תאי T, כולל גיוס אבי התיעוב, דינמיקת עין התימוס, וצעדי יציאה בוגרים של תאי T ב-vivo.
