この方法は、自己免疫、免疫不全、中央耐性、胸腺の不全のメカニズムに関する免疫学分野の主要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、血管化および移植されたマウス胸腺セグメント内の前駆細胞の動員および成熟したT細胞の出口のインビボ縦方向の記録を可能にすることです。この方法は、胸腺の発達および機能に関する洞察を提供することができるが、膵島または腎臓糸球体リなどの他の組織にも適用することができる。
胸腺を分離するには、薄層流れフードの後回りの直立位置に無菌吸収性ペーパータオルの上にマウスを置き、70%エタノールでマウス腹部をスプレーして拭きます。下腹部の表面的なV字型切開を行い、胸腔を露出させ、まっすぐな10センチメートルの解剖ハサミを使用して、腹側の正中線に沿って胸部に0.5〜1センチメートルの切開を行います。胸部の両側に皮膚を折り畳んで胸腔を露出させ、隔膜と肋骨ケージを通して2つの深い0.5〜1センチメートルの側面切開を行い、胸部前胸腔の優れた遠心部にアクセスします。
胸腺は、心臓のすぐ上に2つの淡い葉として表示されるはずです。胸腺の下に湾曲した鉗子先端を置き、垂直に引っ張って完全な器官を抽出し、まっすぐな鉗子で胸部の折り畳みを防ぎます。その後、氷の上に冷たい滅菌PBSを含む滅菌60ミリリットル皿に孤立した胸腺を沈め、メスを使用して結合性地峡を切断して胸腺葉を分離する。
移植前に、各レシピエントマウスをタグ付けし、重み付けし、解剖顕微鏡のレンズに直接露出した片目で最初の動物を側面横方向リカンベント位置に置きます。Vannasはさみを使用して、ジグザグパターンに従って1ミリメートルまでの幅で孤立した胸腺ローブの1つを切除し、各セグメントに胸腺皮質および髄質組織が含まれていることを確認する。大きな部分が適切に生着しない可能性があるため、移植の直前に胸腺をトリミングすることが重要です。
次に、手術領域の角膜の基部から始めて、40ミリメートル18ゲージ針の先端を使用して、外的な角膜層に小さな切開を行い、一対の解剖ハサミの先端を導入できるようにします。はさみを使用して角膜の基部の周りに直接5〜10ミリメートルの側面の切開を行い、平らな鉗子を使用して角膜をしっかりと開いて再シールを防ぎます。切断した角膜上皮を平らな鉗子でつかみ、開口部を通して胸腺セグメントを挿入しながら角膜の開口部を維持する。
組織が導入される前に自発的な再シールを防ぐために、角膜開口部を通して胸腺片を素早く挿入することが重要です。このステップで組織の完全性を維持するように注意してください。眼の表面を柔らかく押して、導入した組織セグメントを瞳孔に対して横位置にスライドさせて、眼の機能を維持します。
そして、平らな鉗子を使用して、角膜開口部の両側を3〜5秒間しっかりと押し合い、自己シールを促進します。両方の目に移植を行う場合は、ちょうど実証したように、2番目の移植のためにマウスを反対側の側面に回します。手術が完了したら、完全な再発まで監視付きのヒートランプであらかじめ温めた空のケージにマウスを戻します。
適切な実験時に、麻酔されたレシピエントマウスを固定ステージ顕微鏡プラットフォーム上に置き、片方の目を上に向けたヒートパッドの側面横方向リカンベント位置に置きます。そして、ステレオタックスヘッドホルダーにマウスの頭を挿入します。マウスヘッドを横方向の位置に拘束して、胸腺移植片を保持する目に顕微鏡の目的を直接アクセスできるように調整し、UST-2固体ユニバーサルジョイントに取り付けられたポリエチレンチューブで覆われた一対のツイーザーチップで角膜マージンで目を保持しながらまぶたを引き戻します。
5X顕微鏡の目的をマウスの目に置き、顕微鏡フィールドに胸腺を配置する前に、角膜とレンズの間に滅菌生理食いまたは人工涙を数滴加えます。次に、長時間作動距離で高分解能の水浸漬目標に切り替え、顕微鏡ソフトウェアで取得モードを選択します。共振スキャナモードを開始し、XYZTイメージングモードを選択します。
アルゴンレーザーをオンにし、蛍光励起のために30%に電力を調整します。適切な励起レーザラインを選択し、反射検出を同時に使用して適切な発光波長のアヌースト光光光スプリッタ制御を設定し、後方散乱を検出し、組織構造を線引きします。選択した波長で発光を収集し、512 x 512 ピクセルの解像度を設定します。
次に、[ライブ] をクリックしてイメージングを開始し、必要に応じてゲイン レベルを調整します。胸腺インプラントの上部に焦点を当て、Zスタックの始まりを定義し始めます。次に、視覚化できる埋め込み胸腺の最後の平面に焦点を当て、5マイクロメートルのZステップサイズを使用してZスタックの終点を定義するために端を選択します。
各 Z スタックの取得時間間隔を 1.5 ~ 2 秒間設定し、連続イメージングの取得停止オプションを選択します。次に、[開始] をクリックして録音を初期化します。ここでは、胸腺インプラントの同じ領域の明視野および蛍光画像が、組織の成長およびインボルリューションおよび継続研究の二重巨視的フォローアップに役立つ可能性がある。
明視野画像はまた、移植された組織の血管化の視覚化を容易にし、時間の経過とともに胸腺生理学の血液供給への依存性のユニークな研究を可能にする。このモデルは、血液急流から移植された胸腺への細胞転移の視覚化、分化および選択プロセス中にRFP標識された常駐胸腺上皮および間質細胞を有する胸腺インプラントに入るGFP陽性前駆細胞間の接触の追跡、ならびに胸腺から末梢血管への通行免疫細胞のモニタリングを可能にする。この手順を試みる間、最適な生着のために組織暴露を最小限に抑え、また、治癒中に線維症を減らしながら角膜を通して無傷の断片切除を可能にするために目の切開サイズを制限することを覚えておくことが重要です。
この手順に従って、局在した対照治療および他の組織を対側眼に切開するような他の方法は、感染症、インボルリューション決定因子、および移植耐性メカニズムに関連する免疫機能障害に関する追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者が、前駆細胞の採用、胸腺-眼球ダイナミクス、および生体内の成熟したT細胞出口ステップを含むT細胞の発達を探求する道を開いた。
