Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’immunologie sur les mécanismes de l’auto-immunité, l’immunodéficience, la tolérance centrale, et l’involution thymus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’enregistrement longitudinal in vivo du recrutement d’ancêtre et de l’égression mature de T-cellule dans les segments vascularisés et greffés de thymus de souris. Bien que cette méthode peut fournir un aperçu du développement et la fonction du thymus, peut également être appliquée à d’autres tissus tels que les îlots pancréatiques ou glomeruli rein.
Pour isoler le thymus, placez la souris sur des serviettes en papier absorbant stériles en position verticale dorsale dans une hotte d’écoulement laminaire et vaporisez et essuyez l’abdomen de la souris avec 70% d’éthanol. Faire une incision superficielle en forme de V dans le bas-ventre pour exposer la cavité thoracique et utiliser une paire de ciseaux de dissecting droite de 10 centimètres pour faire une incision de 0,5 à un centimètre dans la poitrine le long de la ligne médiane ventrale. Pliez la peau de chaque côté de la poitrine pour exposer la cavité thoracique et faire deux incisions latérales plus profondes de 0,5 à un centimètre à travers le diaphragme et la cage thoracique pour accéder au mediastinum supérieur dans la cavité thoracique antérieure.
Le thymus doit apparaître sous forme de deux lobes pâles juste au-dessus du cœur. Placez des pointes de force incurvées sous le thymus et tirez verticalement pour extraire l’organe complet, empêchant le repli de la cage thoracique avec une paire de forceps droits. Puis submergez le thymus isolé dans un plat stérile de 60 millilitres contenant du PBS stérile froid sur la glace et utilisez un scalpel pour couper l’isthme conjonctif pour séparer les lobes thymiques.
Avant la transplantation, étiqueter et peser chaque souris receveur et placer le premier animal dans une position latérale couchée latérale avec un œil directement exposé à la lentille d’un microscope disséquant. À l’aide de ciseaux Vannas, exciser l’un des lobes thymiques isolés jusqu’à un millimètre de largeur suivant un motif de zigzag pour s’assurer que chaque segment contient du cortex thymique et du tissu médullaire. Il est essentiel de couper le thymus juste avant l’implantation car les gros morceaux peuvent ne pas se greffer correctement.
Ensuite, à partir de la base de la cornée de la zone chirurgicale, utilisez la pointe d’une aiguille de calibre 18 de 40 millimètres pour faire une petite incision dans les couches externes de cornée afin que la pointe d’une paire de ciseaux disséquants puisse être introduite. Utilisez les ciseaux pour faire une incision de flanc de cinq à 10 millimètres directement autour de la base de la cornée tout en utilisant des forceps plats pour maintenir fermement la cornée ouverte pour empêcher le résealing. Saisir l’épithélium cornéen coupé avec les forceps plats, maintenir l’ouverture dans la cornée tout en insérant un segment thymique par l’ouverture.
Il est important d’insérer le morceau de thymus rapidement par l’ouverture cornéenne pour empêcher le résealing spontané avant que le tissu soit introduit. Veillez à préserver l’intégrité des tissus à cette étape. Appuyez doucement sur la surface des yeux pour faire glisser le segment de tissu introduit à une position latérale par rapport à la pupille pour préserver la fonction de l’œil.
Et utilisez des forceps plats pour appuyer sur les deux côtés de l’ouverture cornéenne fermement les uns contre les autres pendant trois à cinq secondes pour favoriser l’auto-scellement. Si la greffe doit être effectuée sur les deux yeux, tournez la souris sur le côté latéral opposé pour une deuxième implantation comme nous venons de le démontrer. Lorsque la chirurgie est terminée, retourner la souris dans une cage vide préchauffée à l’aide d’une lampe thermique avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement couchée.
Au moment expérimental approprié, placez une souris bénéficiaire anesthésiée sur une plate-forme de microscope à stade fixe dans une position latérale couchée latérale sur un coussin chauffant avec un œil face vers le haut. Et insérez la tête de la souris dans un porte-tête stéréotaxique. Ajustez le bouton pour retenir la tête de la souris en position latérale pour permettre un accès direct de l’objectif microscope à l’œil tenant la greffe de thymus et retirez les paupières tout en tenant l’œil à la marge cornéenne avec une paire de pointes de pince à épiler recouvertes d’un tube de polyéthylène attaché à un joint universel solide UST-2.
Ajouter quelques gouttes de larmes salines stériles ou artificielles entre la cornée et la lentille avant de placer l’objectif microscope 5X sur l’œil de la souris et de localiser le thymus dans le champ microscope. Passez ensuite à un objectif d’immersion d’eau à haute résolution avec une longue distance de travail et sélectionnez le mode d’acquisition dans le logiciel microscope. Démarrez le mode scanner de résonance et sélectionnez le mode d’imagerie XYZT.
Allumez le laser argon et ajustez la puissance à 30% pour l’excitation de fluorescence. Sélectionnez une ligne laser d’excitation appropriée et réglez le contrôle du séparateur de faisceau acousto-optique pour les longueurs d’onde d’émission appropriées à l’aide de la détection de réflexion simultanément pour détecter la rétrocédérateur et délimité la structure tissulaire. Collecter l’émission à la longueur d’onde sélectionnée et définir une résolution de 512 par 512 pixels.
Cliquez ensuite en direct pour démarrer l’imagerie, en ajustant les niveaux de gain au besoin. Concentrez-vous sur le dessus de l’implant thymique et sélectionnez commencer à définir le début de la pile Z. Ensuite, concentrez-vous sur le dernier plan du thymus implanté qui peut être visualisé et sélectionnez l’extrémité pour définir l’extrémité de la pile Z à l’aide d’une taille en z-step de cinq micromètres.
Définissez l’intervalle de temps pour l’acquisition de chaque pile Z pendant 1,5 à 2 secondes et sélectionnez l’option d’acquisition jusqu’à l’arrêt pour l’imagerie continue. Cliquez ensuite pour commencer à para paraize l’enregistrement. Ici, des images de champ lumineux et de fluorescence de la même zone de l’implant thymus qui peuvent servir à un double suivi macroscopique de la croissance des tissus et des études d’involution et de continuation sont montrées.
L’image de champ lumineux facilite également la visualisation de la vascularisation du tissu implanté, permettant l’étude unique de la dépendance de la physiologie du thymus sur l’approvisionnement en sang au fil du temps. Ce modèle permet la visualisation de la transmigration cellulaire du torrent sanguin dans le thymus implanté, le suivi des contacts entre les cellules progénitrices gfp-positives entrant dans l’implant thymique avec des cellules épithéliales thymiques résidentes et stromal étiquetées RFP pendant les processus de différenciation et de sélection, ainsi que la surveillance des cellules immunitaires égressives du thymus dans les vaisseaux sanguins périphériques. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de réduire au minimum l’exposition de tissu pour l’engraftment optimal et également de limiter la taille d’incision dans l’oeil pour permettre l’excision indemne de fragment par la cornée tout en réduisant la fibrose pendant la guérison.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme les traitements de contrôle localisés et l’incision d’autres tissus dans l’œil contralatéral peuvent être effectuées de façon à répondre à d’autres questions sur les dysfonctionnements immunitaires liés aux infections, les déterminants de l’involution et les mécanismes de tolérance à la transplantation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer le développement des cellules T, y compris le recrutement d’ancêtre, la dynamique thymus-oeil, et les étapes matures d’évacuation des cellules T in vivo.
