이 방법은 자기 면역, 면역 결핍, 중앙 내성 및 흉부 불응력의 기계장치에 관하여 면역학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 혈관 및 접목 마우스 흉선 세그먼트 내에서 선조 모집 및 성숙한 T 세포 환귀의 생체 내 세로 기록을 허용한다는 것입니다. 이 방법은 흉선의 발달 그리고 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 췌장 섬이나 신장 구술과 같은 다른 조직에도 적용 될 수 있습니다.
흉기를 분리하려면 마우스를 등쪽 수직 위치에 멸균 흡수성 종이 타월에 라미나르 플로우 후드에 놓고 70%에탄올로 마우스 복부를 닦아냅니다. 아래 복부에 피상적 V 자형 절개를 만들어 흉부 구멍을 노출하고 직선 10 센티미터 해부 가위를 사용하여 복부 미드 라인을 따라 가슴에 0.5 ~ 1 센티미터 절개를합니다. 흉부 구멍을 노출하고 격막과 흉곽 구멍을 통해 두 개의 추가 깊은 0.5 ~ 1 센티미터 측면 절개를 만들기 위해 가슴의 각 측면에 피부를 접을.
흉선은 심장 바로 위에 두 개의 창백한 엽으로 나타나야합니다. 곡면 포프 팁을 흉막 아래에 놓고 수직으로 당겨 전체 장기를 추출하여 흉곽의 접이식 뒷면을 직선 집게로 방지합니다. 그런 다음 얼음에 차가운 멸균 PBS를 포함하는 멸균 60 밀리리터 접시에 고립 된 흉선을 잠그고 메스를 사용하여 결합 된 이스머스를 잘라 백리믹 로브를 분리합니다.
이식하기 전에 각 수신자 마우스를 태그하고 계량하고 첫 번째 동물을 측면 측측 억양 위치에 놓고 한 쪽 눈이 해부 현미경의 렌즈에 직접 노출됩니다. Vannas 가위를 사용하여, 각 세그먼트가 일부 흉피질과 medulla 조직을 포함하는지 확인하기 위해 지그재그 패턴에 따라 폭1 밀리미터까지 고립 된 흉엽 중 하나를 소비합니다. 큰 조각이 제대로 이식되지 않을 수 있으므로 이식 직전에 흉을 손질하는 것이 중요합니다.
다음으로, 수술 영역의 각막 기저에서 시작하여 40mm 18 게이지 바늘의 끝을 사용하여 외부 각막 층으로 작은 절개를 하여 한 쌍의 해부 가위 끝이 도입될 수 있도록 한다. 가위를 사용하여 각막 의 기지 바로 주위5 ~ 10mm 측면 절개를 만드는 동시에 평평한 단조 포셉을 사용하여 각막을 단단히 고정하여 재밀봉을 방지합니다. 평평한 집게로 컷 각막 상피를 잡고, 개구부를 통해 티믹 세그먼트를 삽입하면서 각막의 개구부를 유지합니다.
조직이 도입되기 전에 자발적인 재밀봉을 방지하기 위해 각막 개구부를 통해 흉막 조각을 신속하게 삽입하는 것이 중요합니다. 이 단계에서 조직의 무결성을 보존하십시오. 눈 표면에 부드럽게 눌러 도입된 조직 세그먼트를 눈의 기능을 보존하기 위해 동공에 대하여 측면 위치로 밀어 놓습니다.
그리고 평평한 집게를 사용하여 각막 의 양쪽을 3~5초 동안 서로 단단히 눌러 자체 밀봉을 촉진합니다. 이식이 양쪽 눈에 수행될 경우, 마우스를 두 번째 이식을 위해 반대쪽 측면으로 돌리십시오. 수술이 완료되면 마우스를 완전한 재복이 있을 때까지 모니터링할 수 있는 열램프로 미리 데워진 빈 케이지로 마우스를 되돌려 놓습니다.
적절한 실험 시점에서 마취된 수신자 마우스를 한쪽 눈을 향한 열패드에 측면 측면 측면 재배치 위치에 고정 단계 현미경 플랫폼에 놓습니다. 그리고 마우스의 머리를 스테레오 탈탁 헤드 홀더에 삽입합니다. 마우스 헤드를 측면 위치에 고정하여 흉선 접목을 잡고 눈꺼풀을 당기고, UST-2 고체 범용 조인트에 부착된 폴리에틸렌 튜브로 덮인 트윈팁 한 쌍의 트위저 팁으로 눈꺼풀을 뒤로 당깁니다.
마우스 눈에 5X 현미경 목표를 배치하고 현미경 필드에 흉분을 찾기 전에 각막과 렌즈 사이에 멸균 식염수 또는 인공 눈물 의 몇 방울을 추가합니다. 그런 다음 장거리 작업 거리로 고해상도 수분 침지 침지 목표로 전환하고 현미경 소프트웨어에서 획득 모드를 선택합니다. 공진 스캐너 모드를 시작하고 XYZT 이미징 모드를 선택합니다.
아르곤 레이저를 켜고 형광 흥분을 위해 전력을 30 %로 조정합니다. 적절한 흥분 레이저 라인을 선택하고 반사 감지를 사용하여 적절한 방출 파장에 대한 아쿠스토 광학 빔 스플리터 제어를 설정하여 백스캐터를 감지하고 조직 구조를 묘사합니다. 선택한 파장에서 배출을 수집하고 512x512 픽셀 해상도를 설정합니다.
그런 다음 라이브를 클릭하여 이미징을 시작하여 필요에 따라 게인 수준을 조정합니다. 흉부 임플란트의 상단에 초점을 맞추고 선택하여 Z 스택의 시작을 정의하기 시작합니다. 그런 다음 5 마이크로미터의 Z 단계 크기를 사용하여 Z 스택의 끝을 정의하기 위해 시각화할 수 있는 이식된 흉선의 마지막 평면에 초점을 맞추고 끝을 선택합니다.
각 Z 스택을 획득하기 위한 시간 간격을 1.5초에서 2초 동안 설정하고 연속 이미징을 위한 획득-중지 옵션을 선택합니다. 그런 다음 레코딩을 초기화하기 시작하려면 클릭합니다. 여기서, 조직 성장 및 연속성 및 연속 연구의 이중 거시적 후속을 위해 봉사할 수 있는 흉선 임플란트의 동일한 영역의 밝은 필드 및 형광 심상이 나타난다.
밝은 필드 이미지는 또한 이식 된 조직의 혈관화의 시각화를 용이하게, 시간이 지남에 따라 혈액 공급에 흉선 생리학의 의존성의 독특한 연구를 허용. 이 모델은 혈액 토런트에서 이식된 흉선으로세포 의 전이, RFP 표지된 상피 및 선택 과정 동안 흉부 임플란트에 들어가는 GFP 양성 전구 세포 사이의 접촉 추적, 흉부에서 백혈구의 세포 배설을 배분할 수 있게 한다. 이 절차를 시도하는 동안, 최적의 이식을위한 조직 노출을 최소화하고 또한 치유 하는 동안 섬유증을 감소 하는 동안 각막을 통해 무해 한 단편 절개를 허용 하는 눈의 절개 크기를 제한 하는 것을 기억 하는 것이 중요 하다.
이 절차에 따라, 지역화 된 제어 치료 및 다른 조직의 절개와 같은 다른 방법은 감염, 불응성 결정요인 및 이식 내성 메커니즘에 연결된 면역 기능 장애에 대한 추가 질문에 대답할 수 있도록 수행 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 면역학 분야의 연구원들이 선조 모집, 흉선 눈 역학 및 생체 내 성숙한 T 세포 퇴각 단계를 포함하여 T 세포 개발을 탐구할 수있는 길을 열었습니다.
