Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo immunologico sui meccanismi di autoimmunità, immunodeficienza, tolleranza centrale e involuzione del timo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la registrazione longitudinale in vivo del reclutamento del progenitore e dell'egressione matura delle cellule T all'interno di segmenti di timo del topo vascolarizzati e innestati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo e sulla funzione del timo, può essere applicato anche ad altri tessuti come isolotti pancreatici o glomeruli renali.
Per isolare il timo, posizionare il mouse su asciugamani di carta assorbenti sterili nella posizione verticale dorsale in un cappuccio di flusso laminare e spruzzare e pulire l'addome del topo con il 70% di etanolo. Fai un'incisione superficiale a forma di V nell'addome inferiore per esporre la cavità toracica e usa un paio di forbici sezionanti dritte da 10 centimetri per fare un'incisione da 0,5 a un centimetro nel petto lungo la linea mediana ventrale. Piegare la pelle su ciascun lato del torace per esporre la cavità toracica e fare altre due incisioni laterali più profonde da 0,5 a un centimetro attraverso il diaframma e la gabbia toracica per accedere al mediastino superiore nella cavità toracica anteriore.
Il timo dovrebbe apparire come due lobi pallidi proprio sopra il cuore. Posizionare le punte curve sotto il timo e tirare verticalmente per estrarre l'organo completo, impedendo la ripiegatura della gabbia toracica con un paio di forcette dritte. Quindi immergere il timo isolato in un piatto sterile da 60 millilitri contenente PBS sterile freddo sul ghiaccio e utilizzare un bisturi per tagliare l'istmo connettivo per separare i lobi timici.
Prima del trapianto, etichettare e pesare ogni topo ricevente e posizionare il primo animale in posizione reclinata laterale con un occhio direttamente esposto alla lente di un microscopio sezionante. Usando le forbici Vannas, asporta uno dei lobi timici isolati fino a un millimetro di larghezza seguendo un modello a zig-zag per garantire che ogni segmento contenga un po 'di corteccia timica e tessuto midollare. È fondamentale tagliare il timo proprio prima dell'impianto poiché i pezzi di grandi dimensioni potrebbero non essere accinnesciti correttamente.
Successivamente, partendo dalla base della cornea dell'area chirurgica, utilizzare la punta di un ago calibro 18 di 40 millimetri per fare una piccola incisione in strati esterni di cornea in modo da poter introdurre la punta di un paio di forbici sezionanti. Usa le forbici per fare un'incisione del fianco da cinque a 10 millimetri direttamente intorno alla base della cornea mentre usi forcelle a terminazione piatta per tenere saldamente aperta la cornea per evitare il riposigillamento. Afferrando l'epitelio corneale tagliato con le forcep piatte, mantenere l'apertura nella cornea mentre si inserisce un segmento timico attraverso l'apertura.
È importante inserire rapidamente il pezzo di timo attraverso l'apertura corneale per evitare il riposigillamento spontaneo prima dell'introduzione del tessuto. Fai attenzione a preservare l'integrità dei tessuti in questo passaggio. Premere dolcemente sulla superficie oculare per far scorrere il segmento tissutale introdotto in una posizione laterale rispetto alla pupilla per preservare la funzione dell'occhio.
E usa le forcelle piatte per premere saldamente entrambi i lati dell'apertura corneale l'uno contro l'altro per tre o cinque secondi per promuovere l'autosigillamento. Se il trapianto deve essere eseguito su entrambi gli occhi, ruotare il mouse sul lato laterale opposto per un secondo impianto come appena dimostrato. Al termine dell'intervento chirurgico, riportare il mouse in una gabbia vuota pre-riscaldata con una lampada termica con monitoraggio fino alla piena rimpasto.
Nel momento sperimentale appropriato, posizionare un mouse ricevente anestetizzato su una piattaforma di microscopio a stadio fisso in posizione reclinata laterale su un riscaldatore con un occhio rivolto verso l'alto. E inserire la testa del mouse in un portacapo stereotassico. Regolare la manopola per trattenere la testa del mouse nella posizione laterale laterale per consentire l'accesso diretto dell'obiettivo del microscopio all'occhio che tiene l'innesto di timo e tirare indietro le palpebre tenendo l'occhio al margine corneale con un paio di punte di tweezer coperte da un tubo di polietilene attaccato a un giunto universale solido UST-2.
Aggiungere alcune gocce di lacrime soluzione salina o artificiale sterili tra la cornea e l'obiettivo prima di posizionare l'obiettivo del microscopio 5X sull'occhio del mouse e individuare il timo nel campo del microscopio. Quindi passare a un obiettivo di immersione in acqua ad alta risoluzione con una lunga distanza di lavoro e selezionare la modalità di acquisizione nel software del microscopio. Avviare la modalità scanner di risonanza e selezionare la modalità di imaging XYZT.
Accendere il laser argon e regolare la potenza al 30% per l'eccitazione a fluorescenza. Selezionare una linea laser di eccitazione appropriata e impostare il controllo dello splitter del fascio acousto-ottico per le lunghezze d'onda di emissione appropriate utilizzando il rilevamento della riflessione contemporaneamente per rilevare il backscatter e delineare la struttura tissutale. Raccogliere l'emissione alla lunghezza d'onda selezionata e impostare una risoluzione di 512 x 512 pixel.
Quindi fai clic dal vivo per avviare l'imaging, regolando i livelli di guadagno in base alle esigenze. Concentrati sulla parte superiore dell'impianto timico e seleziona inizia a definire l'inizio della pila Z. Quindi concentrati sull'ultimo piano nel timo impiantato che può essere visualizzato e seleziona l'estremità per definire l'estremità della pila Z usando una dimensione del passo Z di cinque micrometri.
Impostare l'intervallo di tempo per l'acquisizione di ogni stack Z da 1,5 a due secondi e selezionare l'opzione acquire-until-stopped per l'imaging continuo. Quindi fare clic su Avvia per inizializzare la registrazione. Qui vengono mostrate immagini a campo luminoso e a fluorescenza della stessa area dell'impianto del timo che possono servire per un doppio follow-up macroscopico della crescita dei tessuti e degli studi di involuzione e continuazione.
L'immagine a campo luminoso facilita anche la visualizzazione della vascolarizzazione del tessuto impiantato, consentendo lo studio unico della dipendenza della fisiologia del timo dall'apporto di sangue nel tempo. Questo modello consente la visualizzazione della trasmigrazione cellulare dal torrente sanguigno nel timo impiantato, il tracciamento dei contatti tra le cellule progenitrici positive alla GFP che entrano nell'impianto timico con cellule epiteliali e stromali tiroidee residenti etichettate RFP durante i processi di differenziazione e selezione, nonché il monitoraggio delle cellule immunitarie egressive dal timo ai vasi sanguigni periferici. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo l'esposizione dei tessuti per un innesto ottimale e anche di limitare le dimensioni dell'incisione nell'occhio per consentire l'escissione del frammento illesa attraverso la cornea riducendo al contempo la fibrosi durante la guarigione.
Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come i trattamenti di controllo localizzati e l'incisione di altri tessuti nell'occhio contralaterale in modo da rispondere a ulteriori domande sulle disfunzioni immunitarie legate a infezioni, determinanti dell'involuzione e meccanismi di tolleranza al trapianto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare lo sviluppo delle cellule T, tra cui il reclutamento del progenitore, la dinamica timo-occhio e le fasi mature di egressione delle cellule T in vivo.
