Bu yöntem, immünoloji alanında otoimmünite, immün yetmezlik, merkezi tolerans ve timus involution mekanizmaları hakkında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, vaskülarize ve aşılı fare timus segmentleri içinde ata alımı nın ve olgun T-hücre çıkışLarının in vivo longitudinal kaydına izin vermedir. Bu yöntem timus gelişimi ve fonksiyonu içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda pankreas adacıkları veya böbrek glomeruli gibi diğer dokulara uygulanabilir.
Timus izole etmek için, bir laminar akış kaputve sprey ve% 70 etanol ile fare karın silin dorsal dik pozisyonda steril emici kağıt havlu üzerine fare yerleştirin. Torasik boşluğu ortaya çıkarmak için alt karın yüzeysel V şeklinde bir kesi yapmak ve ventral orta hat boyunca göğüs 0,5 ila bir santimetrelik kesi yapmak için düz 10 santimetrelik diseksiyon makası bir çift kullanın. Göğüs boşluğu ortaya çıkarmak için göğüs her iki tarafında deri katlayın ve ön torasik kavitede üstün mediasten erişmek için diyafram ve göğüs kafesi ile iki ek daha derin 0.5 ila bir santimetre lateral kesiler yapmak.
Timus kalbin hemen üzerinde iki soluk lob lar olarak görünmelidir. Timus altında kavisli forcep uçları yerleştirin ve düz forseps bir çift ile göğüs kafesi katlanabilir önlenmesi, tam organ ayıklamak için dikey olarak çekin. Sonra buz üzerinde soğuk steril PBS içeren steril 60 mililitrelik çanak izole timus batırın ve timik loblar ayırmak için bağ istmus kesmek için bir neşter kullanın.
Transplantasyondan önce, her alıcı fareyi etiketleyin ve tarayın ve ilk hayvanı bir gözü doğrudan bir diseksiyon mikroskobunun merceği ne rezeke siyle yan yanal recumbent pozisyonuna yerleştirin. Vannas makas kullanarak, her segmentte bazı timik korteks ve medulla doku içerdiğinden emin olmak için bir zikzak desen aşağıdaki genişliği bir milimetreye kadar izole timik loblar biri excise. Büyük parçalar düzgün bir şekilde engraft olmayabilir gibi implantasyon hemen önce timus kırpmak için önemlidir.
Daha sonra, cerrahi alanın kornea tabanından başlayarak, dış kornea tabakaları içine küçük bir kesi yapmak için 40 milimetrelik 18-gauge iğne ucu kullanın böylece bir çift mezhebin ucu tanıtılabilen bir çift makas. Tekrar sızdırmazlığı önlemek için korneayı sıkıca açık tutmak için düz uçlu çerkezlikler kullanırken, korneanın tabanının etrafında doğrudan 5 ila 10 milimetrelik bir yan kesi yapmak için makas kullanın. Kesme kornea epitelini düz uçlu enfazla tutarak, açılıştan bir timik segment yerleştirirken korneadaki açıklığı koruyun.
Doku kullanılmadan önce spontan tekrarsıza neden olmak için timus parçasını kornea açıklığına hızlı bir şekilde yerleştirmek önemlidir. Bu adımda doku bütünlüğünü korumak için dikkatli olun. Göz işlevini korumak için göz bebeği ile ilgili olarak yanal bir konuma tanıtılan doku segmentini slayt için göz yüzeyine hafifçe basın.
Ve kendi kendini mühürleme teşvik etmek için üç ila beş saniye boyunca kornea açma nın her iki tarafını birbirine sıkıca bastırmak için düz forseps kullanın. Eğer nakil her iki gözde yapılacaksa, fareyi sadece gösterildiği gibi ikinci bir implantasyon için karşı lateral tarafa çevirin. Ameliyat tamamlandığında, fareyi tam recumbency kadar izleme ile bir ısı lambası ile önceden ısıtılmış boş bir kafese fare dönün.
Uygun deneysel zaman noktasında, bir gözü yukarı bakacak şekilde bir ısı yastığı üzerinde yan yanal recumbent pozisyonda sabit aşamalı bir mikroskop platformu üzerinde anestezili alıcı fare yerleştirin. Ve farenin başını stereotaksik bir kafa tutucuya takın. Timus greftini tutan göze mikroskop hedefinin doğrudan erişmesine izin vermek ve ust-2 katı evrensel eklemine bağlı polietilen tüple kaplanmış bir çift cızırtı lı uçlarla gözü kornea kenarında tutarken göz kapaklarını geri çekmek için fare kafasını yan pozisyonda dizginlemek için topuzunuzu ayarlayın.
Fare gözüne 5X mikroskop hedefini yerleştirmeden önce kornea ve lens arasına birkaç damla steril salin veya yapay gözyaşı ekleyin ve timusu mikroskop alanında bulun. Daha sonra uzun bir çalışma mesafesi ile daha yüksek çözünürlüklü su daldırma daldırma hedefine geçin ve mikroskop yazılımında edinme modunu seçin. Rezonans tarayıcı modunu başlatın ve XYZT görüntüleme modunu seçin.
Argon lazerini açın ve floresan uyarma için gücü %30'a ayarlayın. Uygun bir uyarma lazer hattı seçin ve arka saçılımı algılamak ve doku yapısını belirlemek için aynı anda yansıma algılama kullanarak uygun emisyon dalga boyları için acousto-optik ışın ayırıcı kontrolü ayarlayın. Samisyonu seçili dalga boyunda toplayın ve 512'ye 512 piksel çözünürlüğü ayarlayın.
Ardından, kazanç düzeylerini gerektiği gibi ayarlayarak görüntülemeyi başlatmak için canlı'yı tıklatın. Timik implantın üstüne odaklanın ve Z destesinin başlangıcını tanımlamaya başlayın' ı seçin. Daha sonra, beş mikrometrelik Z adım boyutu kullanarak Z destesinin ucunu tanımlamak için görüntülenebilen ve ucunu seçebilen implante timustaki son düzleme odaklanın.
Her Z yığınının edinimi için zaman aralığını 1,5 ila iki saniye olarak ayarlayın ve sürekli görüntüleme için satın alma-durdurulan seçeneğini seçin. Ardından kaydı başlatmak için başlat'ı tıklatın. Burada, timus implantının aynı bölgesinin parlak alan ve floresan görüntüleri doku büyümesi ve involution ve devamı çalışmalarının çift makroskopik takibine hizmet edebilir.
Parlak alan görüntüsü aynı zamanda implante edilen dokunun vaskülarizasyonunu görselleştirmeyi de kolaylaştırarak timus fizyolojisinin zaman içinde kan akımına olan bağımlılığının benzersiz bir şekilde araştırılmasını sağlar. Bu model, kan torrentinden implante timusa hücre geçişinin görüntülenmesi, farklılaşma ve seçim süreçleri sırasında RFP etiketli yerleşik timik epitel ve stromal hücrelerle timik implanta giren GFP-pozitif progenitör hücreleri arasındaki temasların izlenmesinin yanı sıra, timustan gelen saldırgan bağışıklık hücrelerinin periferik kan damarlarına izlenmesini sağlar. Bu prosedürü denerken, optimal engraftment için doku maruziyetini en aza indirmek ve aynı zamanda iyileşme sırasında fibrozis azaltırken kornea yoluyla zarar görmemiş parça eksizyonu izin vermek için gözde kesi boyutunu sınırlamak için hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, enfeksiyonlara bağlı immün fonksiyon bozuklukları, involution determinantları ve transplantasyon tolerans mekanizmaları ile ilgili ek soruları cevaplamak için lokalize kontrol tedavileri ve diğer dokuların kontralateral göze kesilmesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra immünoloji alanındaki araştırmacıların ata işe alım, timus-göz dinamiği ve erişkin olgun T-hücre çıkış adımları da dahil olmak üzere T-hücre gelişimini keşfetmelerinin önünü açmıştır.
