Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da imunologia sobre os mecanismos de autoimunidade, imunodeficiência, tolerância central e involução de timo. A principal vantagem dessa técnica é que permite o registro longitudinal in vivo do recrutamento progenitor e a egressão madura de células T nos segmentos de timo de camundongos vascularizados e enxertados. Embora este método possa fornecer uma visão sobre o desenvolvimento e a função do timo, também pode ser aplicado a outros tecidos, como ilhotas pancreáticas ou glomeruli renal.
Para isolar o timo, coloque o rato em toalhas de papel absorvente estéreis na posição dorsal vertical em um capô de fluxo laminar e pulverize e limpe o abdômen do rato com 70% de etanol. Faça uma incisão superficial em forma de V no abdômen inferior para expor a cavidade torácica e use um par de tesouras dissecando 10 centímetros em linha reta para fazer uma incisão de 0,5 a um centímetro no peito ao longo da linha média ventral. Dobre a pele sobre cada lado do peito para expor a cavidade torácica e faça duas incisões laterais adicionais de 0,5 a um centímetro através do diafragma e da caixa torácica para acessar o mediastino superior na cavidade torácica anterior.
O timo deve aparecer como dois lóbulos pálidos bem acima do coração. Coloque as pontas de força curvas sob o timo e puxe verticalmente para extrair o órgão completo, impedindo a dobra traseira da caixa torácica com um par de fórceps retos. Em seguida, submergir o timo isolado em um prato estéril de 60 mililitros contendo PBS estéril frio no gelo e usar um bisturi para cortar o istmo conjuntivo para separar os lóbulos timímicos.
Antes do transplante, marque e pese cada rato receptor e coloque o primeiro animal em uma posição lateral lateral recumbent com um olho diretamente exposto à lente de um microscópio dissecando. Usando uma tesoura Vannas, extireta um dos lobos timímicos isolados de até um milímetro de largura seguindo um padrão em ziguezague para garantir que cada segmento contenha algum córtex timiático e tecido medulla. É fundamental aparar o timo antes da implantação, pois peças grandes podem não ser maltratadas corretamente.
Em seguida, a partir da base da córnea da área cirúrgica, use a ponta de uma agulha de calibre 18 de 40 milímetros para fazer uma pequena incisão em camadas externas de córnea para que a ponta de um par de tesouras dissecando possa ser introduzida. Use a tesoura para fazer uma incisão flanco de 5 a 10 milímetros diretamente ao redor da base da córnea enquanto usa fórceps de ponta plana para manter firmemente a córnea aberta para evitar o resealing. Agarrando o epitélio córnea cortado com as fórceps de ponta plana, mantenha a abertura na córnea ao inserir um segmento timêmico através da abertura.
É importante inserir a peça de timo rapidamente através da abertura da córnea para evitar o resealing espontâneo antes do tecido ser introduzido. Tenha cuidado para preservar a integridade do tecido nesta etapa. Pressione suavemente na superfície dos olhos para deslizar o segmento de tecido introduzido para uma posição lateral em relação à pupila para preservar a função do olho.
E use fórceps planos para pressionar ambos os lados da abertura da córnea firmemente um contra o outro por três a cinco segundos para promover a auto-vedação. Se o transplante for realizado em ambos os olhos, vire o rato para o lado lateral oposto para uma segunda implantação como apenas demonstrado. Quando a cirurgia estiver completa, devolva o rato a uma gaiola vazia pré-aquecida com uma lâmpada de calor com monitoramento até a recumbência total.
No ponto de tempo experimental apropriado, coloque um mouse receptor anestesiado em uma plataforma de microscópio de estágio fixo em uma posição lateral lateral reclinável em uma almofada de calor com um olho voltado para cima. E insira a cabeça do mouse em um suporte de cabeça estereotaxic. Ajuste o botão para conter a cabeça do rato na posição lateral lateral para permitir o acesso direto do objetivo do microscópio ao olho segurando o enxerto de timo e puxe as pálpebras enquanto segura o olho na margem da córnea com um par de pontas de pinça cobertas por um tubo de polietileno ligado a uma articulação universal sólida UST-2.
Adicione algumas gotas de soro fisiológico estéril ou lágrimas artificiais entre a córnea e a lente antes de colocar o objetivo do microscópio 5X no olho do mouse e localizar o timo no campo do microscópio. Em seguida, mude para um objetivo de imersão de água de maior resolução com uma longa distância de trabalho e selecione o modo de aquisição no software de microscópio. Inicie o modo de scanner de ressonância e selecione o modo de imagem XYZT.
Ligue o laser de argônio e ajuste a potência para 30% para excitação de fluorescência. Selecione uma linha laser de excitação apropriada e defina o controle do divisor de feixes óptico para os comprimentos de onda de emissão apropriados usando a detecção de reflexão simultaneamente para detectar backscatter e delinear a estrutura tecidual. Colete a emissão no comprimento de onda selecionado e defina uma resolução de 512 por 512 pixels.
Em seguida, clique ao vivo para iniciar a imagem, ajustando os níveis de ganho conforme necessário. Concentre-se na parte superior do implante timiço e selecione começar a definir o início da pilha Z. Em seguida, concentre-se no último plano no timo implantado que pode ser visualizado e selecione a extremidade para definir a extremidade da pilha Z usando um tamanho de passo Z de cinco micrômetros.
Defina o intervalo de tempo para a aquisição de cada pilha Z por 1,5 a dois segundos e selecione a opção de aquisição até o intervalo para imagens contínuas. Em seguida, clique em iniciar a gravação. Aqui, imagens de campo brilhante e fluorescência da mesma área do implante de timo que pode servir para um duplo acompanhamento macroscópico do crescimento tecidual e estudos de involução e continuação são mostrados.
A imagem de campo brilhante também facilita a visualização da vascularização do tecido implantado, permitindo o estudo único da dependência da fisiologia do timo no suprimento de sangue ao longo do tempo. Este modelo permite a visualização da transmigração celular da torrente sanguínea para o timo implantado, o rastreamento dos contatos entre as células progenitoras GFP-positivas que entram no implante timiço com epiteliais e células estrômicas residentes rotuladas pela RFP durante processos de diferenciação e seleção, bem como o monitoramento das células imunes egressivas do timo ao tímumo em vasos sanguíneos periféricos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar para minimizar a exposição tecidual para o enxerto ideal e também para limitar o tamanho da incisão no olho para permitir excisão de fragmentos ilesos através da córnea enquanto reduz a fibrose durante a cicatrização.
Após esse procedimento, outros métodos como tratamentos de controle localizado e incisão de outros tecidos no olho contralateral podem ser realizados de modo a responder perguntas adicionais sobre disfunções imunológicas ligadas a infecções, determinantes de involução e mecanismos de tolerância ao transplante. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da imunologia explorarem o desenvolvimento de células T, incluindo recrutamento de progenitores, dinâmica de olho de timo e passos maduros de egressão de células T in vivo.
