Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся метаболических установки пути в клетках лейкемии. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет измерять метаболизм первичных клеток лейкемии в режиме реального времени в живых клетках. Начните с разбавления образца костного мозга, полученного от больного лейкемией в PBS в соотношении один к одному.
Осторожно, слой шесть миллилитров разбавленного образца костного мозга более шести миллилитров свежеприготовленной плотности градиента среды в 15 миллилитров конической трубки и отделить клетки по плотности градиентной центрифугации. Используйте трубу Pasteur, чтобы тщательно перенести интерфейсный слой моноядерных ячеек в новую коническую трубку диаметром 50 миллилитров, содержащую пять миллилитров PBS для центробежной стирки. Затем, повторное распределение моноядерных гранул клеток в двух миллилитров стерильных PBS для подсчета.
Разбавить клетки в три раза от 10 до семи клеток на миллилитр концентрации. И добавить один миллилитр клеток к каждой из двух колб T75, содержащих 20 миллилитров RPMI среды для 16 до 24 часов инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%CO2. Между тем, чтобы подготовить пластины для внеклеточного анализа потока, добавьте 12,5 микролитров клеточного клея раствора в каждую колодец из двух, восьми хорошо внеклеточных пластин анализатора потока.
Через 20 минут, аспирировать клей клетки и мыть каждый хорошо два раза с 200 микролитров стерильной воды на стирку. После второй стирки оставьте тарелки в капюшоне до тех пор, пока колодцы не высохнут. И поместите сенсорный картридж вверх дном на лабораторную скамейку.
Разделив утилиту пластины и сенсорный картридж анализатора потока. И заполнить каждый колодец утилиты пластины с 200 микролитров калибранта и каждый ров вокруг внешней стороны скважин с 400 микролитров калибранта. Верните картридж датчика на утилиту пластины, которая в настоящее время содержит калибрант и поместите сборку картриджа в увлажненной 37 градусов по Цельсию инкубатор без CO2 ночь.
Затем включите экстраклеточный анализатор потока и дайте ему прогреться до 37 градусов по Цельсию на ночь. На следующее утро перенесите клетки из колбы в 50 миллилитровых конических труб для центрифугации. И повторно посовечите гранулы в один миллилитр соответствующей экспериментальной среды для подсчета.
Повторное течение клеток в четыре раза от 10 до шести клеток в 400 микролитров экспериментальной средней концентрации. И добавьте 50 микролитров клеток в скважины B через G пластины анализатора потока. И 180 микролитров экспериментальной среды в скважины А и Н в качестве фоновых контрольных скважин.
После центрифугации медленно и осторожно добавляйте 130 микролитров экспериментальной среды к скважинам B через G.И визуально подтверждайте стабильную приверженность клеток дну каждой скважины под микроскопом. Затем верните тарелку анализа потока в увлажненные 37 градусов по Цельсию инкубатор без CO2 в течение 30 минут. За 20 минут до окончания инкубации загрузите соединения в соответствующие инжекторные порты картриджа в соответствии с экспериментальным протоколом, указанным в таблице.
Затем навелит соответствующую внеклеточную программу анализа потока. Запустите программу и замените тарелку с анализом по запросу. В стресс-тесте гликолиза используется только базальная среда, чтобы клетки были лишены питательных веществ.
Первым полученным параметром является базальное подкисление, которое должно отражать количество глюкозы, хранящейся в клетках. После первой инъекции, внеклеточной скорости подкисления увеличивается, как клетки используют глюкозу и может брожения глюкозы для лактата. Олигомицин А во второй инъекции подавляет синтазу АТФ и, таким образом, направляет клетки на производство АТФ главным образом путем гликолиза, вызывая дальнейшее повышение уровня внеклеточного подкисления.
В то время как инъекция 2-Deoxy-D-глюкозы полностью подавляет гликолиз и внеклеточной скорости подкисления падает. В клеточном стресс-тесте мито используется среда, дополненная глутамином и глюкозой, чтобы клетки не были лишены всех питательных веществ. Параметр базального дыхания отражает их базальное метаболическое состояние.
После первой инъекции олигомицином А клетки подавляют митохондриальное дыхание и переключаются на гликолиз, который представлен как снижение скорости потребления кислорода. Вторая и третья инъекции FCCP однако, отсоединяют производство АТФ от дыхания, так что клетки теперь потребляют кислород с максимальной скоростью. И уровень потребления кислорода возрастает до самого высокого значения.
Последняя инъекция ротенона и антимицина Смесь полностью подавляет митохондриальное дыхание, снижая скорость потребления кислорода почти до нуля. При попытке этой процедуры, важно оценить процент взрывов в образце, чтобы убедиться, что метаболические параметры лейкемии только измеряются. При внедрении этого метода тщательная оптимизация должна применяться к условиям выращивания и нормализации данных.
