Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как механизмы миграции нейрональных клеток. Основным преимуществом этого метода является то, что вы можете обнаружить индивидуальную и коллективную миграцию клеток в долгосрочной перспективе. После изоляции 200 миллилитров бактериальной культуры методом щелочного лиза смешайте две плазмиды, так что окончательная концентрация каждого из них составляет четыре микрограмма на микролитр.
Инкубировать плодородные куриные яйца горизонтально при 38 градусах по Цельсию при 70%относительной влажности. Через два с половиной дня используйте 20 миллилитровый шприц с иглой 18 калибра, чтобы исключить пять миллилитров альбумин с заостряной стороны яйца. Запечатай дыру скотчем.
Затем используйте изогнутые ножницы, чтобы вырезать верхнюю часть яичной скорлупы и открыть отверстие, два сантиметра в диаметре. Под стереомикроскопом проверьте стадию развития эмбриона. Печать этого большего отверстия с лентой.
Продолжить инкубацию при 38 градусах по Цельсию и 70 процентов относительной влажности до E5.5. Перед электропорацией приготовьте 10 микролитров упомянутой плазмидной ДНК, окрашенных 0,5 микролитров быстрого зеленого цвета. Также приготовьте 10 миллилитров автоклавного PBS, содержащего 100 единиц на миллилитр пенициллина, и 100 микрограмм на миллилитр стрептомицина.
Используйте микропипютный процессор для приготовления микропипет из стеклянных капиллярных трубок. Вырежьте дистальный кончик микропипета до соответствующего размера поры для введения количества ДНК. Используйте ножницы, чтобы вырезать запечатанную верхнюю оболочку, чтобы вновь открыть отверстие диаметром два с половиной сантиметра и установить яйцо под стерео микроскопом.
Внести несколько капель подготовленного раствора PBS в яйцо. Используя два тонких типса, снимите аллантоевую мембрану, покрывающую эмбрион, будьте осторожны, чтобы не вызвать кровоизлияние. Затем удалите амнион из головы эмбриона.
При повороте головы с microspatula, использовать микропипют подключен к всасывающей трубки, чтобы ввести между 0,1 и один микролитр цветной ДНК в желудочковой полости левой оптической тектум. Поместите электроды типа щипц вокруг целевой области оптического тектума. Используйте генератор импульсов для зарядки предварительного импульса 30 вольт в течение одной миллисекунды с интервалом в пять миллисекунд, а для последующих импульсов в шесть вольт в течение пяти миллисекунд с интервалом в 10 миллисекунд.
После всего этого, печать отверстие с лентой, и продолжать инкубации при 38 градусов по Цельсию и 70 процентов относительной влажности. Замочите электроды в пластиковой тарелке, наполненной PBS, и используйте межродовую щетку, чтобы удалить альбумин. Повторите процесс от первоначальной резки оболочки до электропорации для каждого яйца.
За день до Плоская гора культуры, начал подготовку закодированной культуры клеток Вставить путем добавления автоклава дистиллированной воды в 10 сантиметров клеточной культуры блюдо. Плавать некоторые клетки культуры Вставки на воде. В растворе, содержащем восемь микрограммов на миллилитр ламинина и 80 микрограммов на миллилитр Полли Л, убедившись, что для покрытия вставки.
Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе углекислого газа клеточной культуры. В день культуры на E7.0, удалены ламинин и поли l-лизин раствор из вставки. Затем перенесите вставку на стеклянное дно тарелки, наполненной 1,1 миллилитров среды культуры.
Перенесите блюдо в инкубатор углекислого газа клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию. Установите влажную камеру на перевернутый конфокальный микроскоп с потоком газа 40% кислорода и 5%углекислого газа, и температура 38 градусов по Цельсию. Чтобы начать подготовку образца ткани на вставке, используйте щипцы, чтобы ущипнуть голову эмбриона в шестиметровой клеточной культуры блюдо, содержащее ледяной HBSS.
Используйте два тонких щипц, чтобы изолировать электропотерю оптической тектум. А затем использовать пластиковую капельницы, чтобы передать его в вогнутое стеклянное блюдо на основе черного кремния и заполнены ледяной HBSS. Проверьте положение маркировки под флуоресцентным стереоскопическим микроскопом.
Используя микрохирургический нож, вырежьте тектальную ткань, окружающую маркировку, увекаясь направлением ткани в тектуме. После этого используйте пластиковую капельницы для переноса помеченной ткани в Вставку так, чтобы булавка была прикреплена к вставке. Положите тектальную ткань в нужном направлении и удалите излишки HBSS.
Повторите процесс подготовки тканей для любых других образцов тканей, предназначенных для той же вставки. Затем поместите блюдо в заранее сформированную камеру перевернутого конфокального микроскопа. Используя перевернутый конфокальный микроскоп, проверьте флуоресцентную маркировку и сосредоточьте микроскопическое поле.
Запустите лазерный конфокальный блок. Пример конфокального сканирования для того, чтобы настроить направление и положение ткани вдоль х и у осей в поле. Далее выберите размер сканирования.
Определите интервал и общий диапазон конфокального сканирования по оси z. Возьмите интервал в пять или 10 микрометров для диапазона 100 микрометров. Выберите интервал времени конфокального изображения и общую продолжительность изображения.
После настройки параметров конфокального запуска программы, начните визуализацию. Как только изображение завершено, сочетайте конфокальные изображения на другой оси C для получения изображений z-stack с окончательной фокусной корректировкой в каждый момент времени. Затем приложим изображения стека в разные моменты времени, чтобы построить фильм замедленного действия.
В этом исследовании, миграция клеток обнаруживается в поверхностных слоях через электропорации в Ово, плоская культура клеток крепления, и промежуток времени конфокальные изображения. По касательной мигрирующих клеток и ядер в поверхностных слоях оптической тектумы видны здесь ноль часов, девять часов, 18 часов и 27 часов после начала записи. Фильм замедленного действия с интервалом в 10 минут в течение 28 часов и 50 минут показывает массовое движение мигрирующих клеток и их ядер.
В объединенном фильме отчетливо показано массовое движение мигрирующих ячеек. Направленность миграции клеток можно изучить, сосредоточив внимание на рассеивании ячеек от обозначенного центра во все стороны. Четкие изображения ядерного движения позволяют автоматически отслеживать ядерную миграцию с помощью плагина слежения за частицами.
Временные изменения траекторий тангенциальной миграции можно визуализировать и доказать, что дисперсионная миграция является всенаправленной. Более высокие изображения увеличения могут быть сделаны в пятиминутные интервалы. Исследовать поведение отдельных клеток с последовательным морфологическим изменением ведущего процесса, процесса задней части и ядер.
После этой процедуры может быть выполнена маркировка освещающих действий. Для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как механизмы руководства Аксум.
