Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que les mécanismes de la migration cellulaire neuronale. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez détecter la migration cellulaire individuelle et collective à long terme. Après avoir isolé 200 millilitres de culture bactérienne par la méthode de lyse alcaline, mélanger les deux plasmides, de sorte que la concentration finale de chacun est de quatre microgrammes par microlitre.
Incuber horizontalement les œufs de poulet fertiles à 38 degrés Celsius dans une humidité relative de 70 %. Après deux jours et demi, utiliser une seringue de 20 millilitres avec une aiguille de calibre 18 pour éliminer cinq millilitres d’albumine du côté pointu de l’œuf. Sceller le trou avec du ruban adhésif.
Ensuite, utilisez des ciseaux incurvés pour couper le dessus de la coquille d’œuf et ouvrir un trou de deux centimètres de diamètre. Sous un stéréomicroscope, vérifiez le stade de développement de l’embryon. Scellez ce trou plus grand avec du ruban adhésif.
Poursuivre l’incubation à 38 degrés Celsius et 70 pour cent d’humidité relative jusqu’à e5,5. Avant l’électroporation, préparer 10 microlitres de l’ADN plasmide mentionné coloré avec 0,5 microlitres de vert rapide. En outre, préparez 10 millilitres de PBS autoclavé contenant 100 unités par millilitre de pénicilline, et 100 microgrammes par millilitre de streptomicine.
Utilisez un processeur de micropipette pour préparer des micropipettes faites de tubes capillaires en verre. Couper la pointe distale de la micropipette à une taille de pore appropriée pour la quantité d’ADN à injecter. Utilisez des ciseaux pour couper la coquille supérieure scellée pour rouvrir un trou de deux centimètres et demi de diamètre et régler l’œuf de façon stabily sous le microscope stéréo.
Déposer quelques gouttes de la solution PBS préparée dans l’œuf. À l’aide de deux forceps fins, décoller la membrane allantoïque qui recouvre l’embryon, en prenant soin de ne pas provoquer d’hémorragie. Retirez ensuite l’amnion de la tête de l’embryon.
Tout en tournant la tête avec une microspatule, utilisez une micropipette reliée à un tube d’aspiration, pour injecter entre 0,1 et un microlitre de l’ADN coloré dans la cavité ventriculaire du tectum optique gauche. Placez une paire d’électrodes de type forceps autour de la zone cible du tectum optique. Utilisez le générateur d’impulsions pour charger une prépulsation de 30 volts pendant une milliseconde avec un intervalle de cinq millisecondes, et pour les impulsions subséquentes de six volts pendant cinq millisecondes avec un intervalle de 10 millisecondes.
Après tout cela, sceller le trou avec du ruban adhésif, et continuer à couver à 38 degrés Celsius et 70 pour cent d’humidité relative. Tremper les électrodes dans un plat en plastique rempli de PBS, et utiliser une brosse interdenttale pour enlever l’albumen. Répétez le processus de la coupe initiale de la coquille à l’électroporation pour chaque œuf.
Un jour avant la Culture flat-mount, a commencé à préparer la culture cellulaire codée Insert en ajoutant autoclave à l’eau distillée à un plat de culture cellulaire de 10 centimètres. Flotter quelques inserts de culture cellulaire sur l’eau. À une solution contenant huit microgrammes par laminine millilitre, et 80 microgrammes par millilitre Polly L, en s’assurant de couvrir les inserts.
Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de dioxyde de carbone de culture cellulaire. Le jour de la culture à E7.0, enlevé la laminine et poly l-lysine solution de l’insert. Ensuite, transférez l’insert dans un plat à fond de verre rempli de 1,1 millilitre de milieu de culture.
Transférer le plat à l’incubateur de dioxyde de carbone de culture cellulaire à 37 degrés Celsius. Placez une unité de chambre humide sur un microscope confocal inversé avec un flux de gaz de 40% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone, et une température de 38 degrés Celsius. Pour commencer à préparer un échantillon de tissu sur l’insert, utilisez des forceps pour pincer la tête de l’embryon dans un plat de culture cellulaire de six centimètres contenant du HBSS glacé.
Utilisez deux forceps fins pour isoler le tectum optique électroporé. Et puis utilisez un dropper en plastique pour le transférer dans un plat en verre concave à base de silicium noir et rempli de HBSS glacé. Vérifiez la position de l’étiquetage au microscope stéréoscopique fluorescent.
À l’aide d’un couteau micro chirurgical, découpez le tissu tectal entourant l’étiquetage tout en notant la direction du tissu dans le tectum. Après cela, utilisez un bac à goutte en plastique pour transférer le tissu étiqueté à l’insert afin que le côté broches soit fixé à l’insert. Déposer le tissu tectal dans la direction désirée et enlever tout excès de HBSS.
Répétez le processus de préparation des tissus pour tout autre échantillon de tissu destiné au même insert. Placez ensuite le plat dans la chambre préformée du microscope confocal inversé. À l’aide du microscope confocal inversé, vérifiez l’étiquetage fluorescent et concentrez le champ microscopique.
Démarrez l’unité confoccale laser. Échantillonnez l’analyse confoccale afin d’ajuster la direction et la position du tissu le long des axes x et y dans le champ. Ensuite, sélectionnez la taille de numérisation.
Décidez de l’intervalle et de la portée totale de l’analyse confoccale le long de l’axe z. Prenez un intervalle de cinq ou 10 micromètres pour la gamme de 100 micromètres. Choisissez l’intervalle de temps de l’imagerie confocale et la durée totale de l’imagerie.
Après avoir défini les paramètres du programme de course confocale, commencez l’imagerie. Une fois l’imagerie terminée, combinez les images confoccales à un axe C différent pour produire des images z-stack avec réglage focal final à chaque point de temps. Ensuite, appendices les images de la pile Z à différents moments pour construire un film time-lapse.
Dans cette étude, la migration cellulaire est détectée en couches superficielles par électroporation à Ovo, la culture cellulaire à montage plat et l’imagerie confocale en accéléré. Les cellules tangentiellement migrantes et les noyaux dans les couches superficielles du tectum optique sont vus ici zéro heures, neuf heures, 18 heures, et 27 heures après le début de l’enregistrement. Un film de 10 minutes sur une période de 28 heures et 50 minutes montre le mouvement de masse des cellules migrantes et de leurs noyaux.
Le film fusionné montre clairement le mouvement de masse des cellules migrantes. La directionnalité de la migration cellulaire peut être examinée en se concentrant sur les cellules dispersantes du centre étiqueté à toutes les directions. Les images claires du mouvement nucléaire, permet le suivi automatique de la migration nucléaire à l’aide d’un plugin de suivi des particules.
Les changements temporels des trajectoires de la migration tangentielle peuvent être visualisés et prouver que la migration de dispersion est omnidirectionnelle. Des images de grossissement plus élevées peuvent être prises dans des intervalles de cinq minutes. Étudier le comportement cellulaire individuel avec le changement morphologique séquentiel du processus principal, du processus de suivi et des noyaux.
Suite à cette procédure, l’étiquetage des actions d’éclairage peut être effectué. Afin de répondre à d’autres questions comme les mécanismes d’orientation Aksum.
