Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come i meccanismi della migrazione delle cellule neuronali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile rilevare la migrazione cellulare individuale e collettiva a lungo termine. Dopo aver isolato 200 millilitri di coltura batterica con il metodo dellalisi alcalina, mescolare i due plasmidi, in modo che la concentrazione finale di ciascuno sia di quattro microgrammi per microlitro.
Incubare le uova di gallina fertili orizzontalmente a 38 gradi Celsius nell'umidità relativa del 70%. Dopo due giorni e mezzo, utilizzare una siringa da 20 millilitri con un ago calibro 18 per eliminare cinque millilitri di albumina dal lato appuntito dell'uovo. Sigillare il foro con del nastro adesivo.
Quindi, utilizzare forbici curve per tagliare la parte superiore del guscio d'uovo e aprire un foro, di due centimetri di diametro. Sotto uno stereomicroscopio, controllare lo stadio di sviluppo dell'embrione. Sigillare questo foro più grande con del nastro adesivo.
Continuare l'incubazione a 38 gradi Celsius e al 70% di umidità relativa fino all'E5,5. Prima dell'elettroporazione, preparare 10 microlitri del DNA plasmide menzionato colorato con 0,5 microlitri di verde veloce. Inoltre, preparare 10 millilitri di PBS autoclavato contenenti 100 unità per millilitro di penicillina e 100 microgrammi per millilitro di streptomicina.
Utilizzare un processore di micropipette per preparare micropipette realizzate con tubi capillari in vetro. Tagliare la punta distale della micropipetta a una dimensione dei pori appropriata per la quantità di DNA da iniettare. Utilizzare le forbici per tagliare il guscio superiore sigillato per riaprire un foro, di due centimetri e mezzo di diametro, e impostare l'uovo stabily sotto il microscopio stereo.
Depositare alcune gocce della soluzione PBS preparata nell'uovo. Usando due forcep fini, staccare la membrana allantoica che copre l'embrione, facendo attenzione a non causare un'emorragia. Quindi rimuovere l'amnione dalla testa dell'embrione.
Durante la rotazione della testa con una microspatta, utilizzare una micropipetta collegata a un tubo di aspirazione, per iniettare tra 0,1 e un microlitro del DNA colorato nella cavità ventricolare del tectum ottico sinistro. Posizionare una coppia di elettrodi di tipo forcep attorno all'area di destinazione del tectum ottico. Utilizzare il generatore di impulsi per caricare un prea impulsi di 30 volt per un millisecondo con un intervallo di cinque millisecondi e per impulsi successivi di sei volt per cinque millisecondi con un intervallo di 10 millisecondi.
Dopo tutto questo, sigillare il foro con nastro adesivo e continuare a incubare a 38 gradi Celsius e al 70% di umidità relativa. Immergere gli elettrodi in un piatto di plastica riempito con PBS e utilizzare un pennello interdentale per rimuovere l'albume. Ripetere il processo dal taglio iniziale del guscio all'elettroporazione per ogni uovo.
Un giorno prima della cultura del montaggio piatto, iniziò a preparare la coltura cellulare codificata Insert aggiungendo autoclave all'acqua distillata a un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri. Galleggiare alcune impostazioni cultura cellulare Inserti sull'acqua. In una soluzione contenente otto microgrammi per millilitro laminina e 80 microgrammi per millilitro Polly L, assicurandosi di coprire gli inserti.
Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius nell'incubatore di anidride carbonica della coltura cellulare. Il giorno della coltura all'E7.0, rimuovere la soluzione di laminina e poli l-lisina dall'inserto. Quindi, trasferire l'inserto su un piatto con fondo di vetro riempito con 1,1 millilitro di mezzo di coltura.
Trasferire il piatto nell'incubatore di anidride carbonica di coltura cellulare a 37 gradi Celsius. Impostare un'unità camera umida su un microscopio confocale invertito con un flusso di gas del 40% di ossigeno e 5% di anidride carbonica e una temperatura di 38 gradi Celsius. Per iniziare a preparare un campione di tessuto sull'inserto, utilizzare le forcep per pizzicare la testa dell'embrione in un piatto di coltura cellulare di sei centimetri contenente HBSS ghiacciato.
Utilizzare due forcep fini per isolare il tectum ottico elettroporato. E poi usa un contagocce di plastica per trasferirlo in una teglia di vetro concavo a base di silicio nero e riempita con HBSS ghiacciato. Controllare la posizione dell'etichettatura al microscopio stereoscopico fluorescente.
Utilizzando un coltello microchir chirurgico, tagliare il tessuto tectale che circonda l'etichettatura mentre si nota la direzione del tessuto nel tectum. Successivamente, utilizzare un contagocce di plastica per trasferire il tessuto etichettato nell'inserto in modo che il lato del perno sia collegato all'inserto. Posare il tessuto tectale nella direzione desiderata e rimuovere l'HBSS in eccesso.
Ripetere il processo di preparazione dei tessuti per qualsiasi altro campione di tessuto destinato allo stesso inserto. Quindi posizionare il piatto nella camera preformata del microscopio confocale invertito. Utilizzando il microscopio confocale invertito, controllare l'etichettatura fluorescente e mettere a fuoco il campo microscopico.
Avviare l'unità confocale laser. Campionare la scansione confocale per regolare la direzione e la posizione del tessuto lungo gli assi x e y nel campo. Selezionare quindi le dimensioni di scansione.
Decidere l'intervallo e l'intervallo totale della scansione confocale lungo l'asse z. Prendi un intervallo di cinque o 10 micrometri per l'intervallo di 100 micrometri. Scegliere l'intervallo di tempo dell'imaging confocale e la durata totale dell'imaging.
Dopo aver impostazione i parametri del programma di esecuzione confocale, iniziare l'imaging. Una volta completata l'imaging, combina le immagini confocali su un diverso asse C per produrre immagini z-stack con regolazione focale finale in ogni punto di tempo. Quindi aggiungi le immagini dello stack Z in diversi punti di tempo per costruire un filmato time-lapse.
In questo studio, la migrazione cellulare viene rilevata in strati superficiali attraverso l'elettroporazione in Ovo, la coltura cellulare a montaggio piatto e l'imaging confocale time-lapse. Le cellule che migrano tangenzialmente e i nuclei negli strati superficiali dello tectum ottico sono visti qui zero ore, nove ore, 18 ore e 27 ore dopo l'inizio della registrazione. Un filmato time-lapse di intervalli di 10 minuti su un periodo di 28 ore e 50 minuti, mostra il movimento di massa delle cellule migratrici e dei loro nuclei.
Il filmato unito mostra chiaramente il movimento di massa delle cellule migrate. La direzionalità della migrazione cellulare può essere esaminata concentrandosi sulle celle di dispersione dal centro etichettato a tutte le direzioni. Le immagini chiare del movimento nucleare, consentono il tracciamento automatico della migrazione nucleare utilizzando un plug-in di tracciamento delle particelle.
I cambiamenti temporali delle traiettorie della migrazione tangenziale possono essere visualizzati e dimostrare che la migrazione di dispersione è omnidirezionale. Immagini di ingrandimento più elevate possono essere scattate a intervalli di cinque minuti. Per indagare il comportamento delle singole cellule con il cambiamento morfologico sequenziale del processo principale, del processo finale e dei nuclei.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire l'etichettatura delle azioni illuminanti. Per rispondere a domande aggiuntive come i meccanismi di guida di Axum.
