يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا التنموية، مثل آليات ترحيل الخلايا العصبية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك الكشف عن الهجرة الفردية والجماعية للخلية على المدى الطويل. بعد عزل 200 ملليلتر من الثقافة البكتيرية من خلال طريقة التحلل القلوية ، اخلطي البلازميدين ، بحيث يكون التركيز النهائي لكل منهما أربعة ميكروغرام لكل ميكرولتر.
احتضان بيض الدجاج الخصب أفقيا في 38 درجة مئوية في الرطوبة النسبية 70٪. بعد يومين ونصف، استخدم حقنة 20 ملليلتر مع إبرة قياس 18 للقضاء على خمسة ملليلتر من الألبومين من الجانب المدبب للبيضة. أغلق الفتحة بشريط
بعد ذلك ، استخدم مقصًا منحنيًا لقطع الجزء العلوي من قشر البيض وفتح حفرة ، قطرها سنتيمترين. تحت منظار مجسم، تحقق من مرحلة تطور الجنين. ختم هذه الحفرة أكبر مع الشريط.
مواصلة الحضانة في 38 درجة مئوية والرطوبة النسبية 70 في المئة حتى E5.5. قبل electroporation، وإعداد 10 ميكرولترات من الحمض النووي plasmid المذكورة الملونة مع 0.5 ميكرولترات من الأخضر السريع. أيضا، إعداد 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني autoclaved تحتوي على 100 وحدة لكل ملليلتر من البنسلين، و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الستربتوميسين.
استخدم معالج ميكروبيبيت لإعداد ميكروبيبتات مصنوعة من أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجية. قطع طرف من micropipette إلى حجم المسام المناسبة لكمية الحمض النووي ليتم حقنها. استخدام مقص لقطع قذيفة أعلى مختومة لإعادة فتح حفرة، اثنين ونصف سنتيمتر في القطر، وتعيين البيضة stabily تحت المجهر ستيريو.
إيداع بضع قطرات من الحل برنامج تلفزيوني أعدت في البيض. باستخدام اثنين من ملقط غرامة، قشر قبالة الغشاء اللانتويك تغطي الجنين، مع الحرص على عدم التسبب في نزيف. ثم قم بإزالة الأمنيون من رأس الجنين.
أثناء تحويل الرأس مع ميكروبساتولا، استخدم ميكروبيبيت متصلة أنبوب شفط، لحقن ما بين 0.1 وميكر واحد من الحمض النووي الملون في تجويف البطين من tectum البصرية اليسرى. ضع زوجًا من أقطاب نوع الملّابس حول المنطقة المستهدفة من الالكتوم البصري. استخدم مولد النبض لشحن نبضة قبل 30 فولت لمدة ميلي ثانية واحدة مع فاصل ميلي ثانية خمسة، وللنبضات اللاحقة من ستة فولت لمدة خمسة مللي ثانية مع فاصل ميلي ثانية 10.
بعد كل هذا، ختم ثقب مع الشريط، والاستمرار في احتضان في 38 درجة مئوية والرطوبة النسبية 70 في المئة. نقع الأقطاب الكهربائية في طبق من البلاستيك مليئة برنامج تلفزيوني، واستخدام فرشاة بين الأسنان لإزالة الألبومين. كرر العملية من القطع الأولي للقذيفة إلى الكهربية لكل بيضة.
قبل يوم واحد من ثقافة جبل شقة، بدأت في إعداد ثقافة الخلية مشفرة إدراج عن طريق إضافة الأوتوكلاف إلى الماء المقطر إلى طبق ثقافة الخلية 10 سنتيمترا. تعويم بعض الخلية الثقافة إدراج على الماء. في حل يحتوي على ثمانية ميكروغرام لكل مللي لامينين، و 80 ميكروغرام لكل ملليلتر بولي L، مع التأكد من تغطية إدراج.
احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في خلية ثقافة ثاني أكسيد الكربون الحاضنة. في يوم الثقافة في E7.0، إزالة محلول اللامينين والبولي l-ليسين من إدراج. ثم، نقل إدراج إلى طبق الزجاج القاع مليئة 1.1 ملليلتر من الثقافة المتوسطة.
نقل الطبق إلى خلية ثقافة ثاني أكسيد الكربون حاضنة في 37 درجة مئوية. تعيين وحدة غرفة رطبة على مجهر مقلوب مع تدفق الغاز من 40٪ الأكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، ودرجة حرارة 38 درجة مئوية. للبدء في إعداد عينة من الأنسجة على إدراج، واستخدام ملقط لقرصة رئيس الجنين في طبق ثقافة الخلية ستة سنتيمترات تحتوي على الجليد الباردة HBSS.
استخدام اثنين من ملقط غرامة لعزل tectum البصرية الكهربائية. ثم استخدام القطارة البلاستيكية لنقلها إلى طبق زجاجي مقعر مقرها مع السيليكون الأسود ومليئة HBSS الجليد الباردة. تحقق من موضع وضع العلامات تحت المجهر المجسّم الفلوري.
باستخدام سكين الجراحية الصغيرة، وقطع النسيج التقطال المحيطة وضع العلامات مع الإشارة إلى اتجاه الأنسجة في tectum. بعد ذلك، استخدم القطارة البلاستيكية لنقل الأنسجة المسماة إلى إدراج بحيث يتم إرفاق الجانب دبوس إلى إدراج. وضع النسيج التكتي في الاتجاه المطلوب وإزالة أي HBSS الزائدة.
كرر عملية إعداد الأنسجة لأي عينات الأنسجة الأخرى المقصودة لنفس إدراج. ثم ضع الطبق في غرفة المجهر المقلوب المقلوب. باستخدام المجهر المقلوب، تحقق من وضع العلامات الفلورية وركز الحقل المجهري.
بدء تشغيل وحدة بالليزر confocal. عينة من فحص confocal من أجل ضبط اتجاه وموقف الأنسجة على طول محاور س وص في الميدان. بعد ذلك، حدد حجم المسح الضوئي.
حدد الفاصل الزمني والمدى الإجمالي للمسح confocal على طول المحور z. خذ فاصلاً من خمسة أو 10 ميكرومترات لنطاق 100 ميكرومتر. اختر الفاصل الزمني للتصوير confocal ومدة التصوير الإجمالية.
بعد وضع المعلمات من برنامج تشغيل confocal ، وبدء التصوير. بمجرد اكتمال التصوير، دمج الصور confocal في محور C مختلفة لإنتاج صور z-المكدس مع التعديل البؤري النهائي في كل نقطة زمنية. ثم إلحاق الصور المكدس Z في نقاط زمنية مختلفة لبناء فيلم الفاصل الزمني.
في هذه الدراسة، يتم الكشف عن هجرة الخلايا في طبقات سطحية من خلال الكهرباء في أوفو، وشقة جبل الخلية، والتصوير confocal الفاصل الزمني. وينظر إلى الخلايا المهاجرة بشكل عرضي والنوى في الطبقات السطحية من tectum البصرية هنا صفر ساعات، تسع ساعات، 18 ساعة، و 27 ساعة بعد بداية التسجيل. فيلم الفاصل الزمني من 10 دقائق على مدى 28 ساعة و 50 دقيقة، ويبين الحركة الجماعية للخلايا المهاجرة والنوى الخاصة بهم.
الفيلم المدمج يظهر بوضوح الحركة الجماعية للخلايا المهاجرة. يمكن فحص اتجاه ترحيل الخلايا من خلال التركيز على الخلايا التشتت من المركز المسمى إلى جميع الاتجاهات. الصور الواضحة للحركة النووية، تسمح بالتتبع التلقائي للهجرة النووية باستخدام مكون إضافي لتتبع الجسيمات.
ويمكن تصور التغيرات الزمنية لمسارات الهجرة الظلية وإثبات أن الهجرة التشتتية هي هجرة شاملة الاتجاه. يمكن التقاط صور تكبير أعلى في فترات زمنية مدتها خمس دقائق. للتحقيق في سلوك الخلية الفردية مع التغيير المورفولوجي التسلسلي للعملية الرائدة ، والعملية اللاحقة ، والنوى.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ تسمية من إجراءات مضيئة. من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل آليات التوجيه أكسوم.
