Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como los mecanismos de la migración de células neuronales. La principal ventaja de esta técnica es que se puede detectar la migración celular individual y colectiva a largo plazo. Después de aislar 200 mililitros de cultivo bacteriano por el método de lysis alcalina, mezcle los dos plásmidos, de forma que la concentración final de cada uno sea de cuatro microgramos por microlitro.
Incubar los huevos de pollo fértiles horizontalmente a 38 grados centígrados en una humedad relativa del 70%. Después de dos días y medio, utilice una jeringa de 20 mililitros con una aguja de calibre 18 para eliminar cinco mililitros de albúmina del lado puntiagudo del huevo. Cierre el agujero con cinta adhesiva.
A continuación, utilice tijeras curvas para cortar la parte superior de la cáscara de huevo y abrir un agujero, de dos centímetros de diámetro. Bajo un estereomicroscopio, compruebe la etapa de desarrollo del embrión. Selle este agujero más grande con cinta adhesiva.
Continúe la incubación a 38 grados centígrados y 70 por ciento de humedad relativa hasta E5.5. Antes de la electroporación, preparar 10 microlitros del ADN plásmido mencionado de coloreado con 0,5 microlitros de verde rápido. Además, preparar 10 mililitros de PBS autoclavado que contenga 100 unidades por mililitro de penicilina, y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina.
Utilice un procesador de micropipetas para preparar micropipetas hechas de tubos capilares de vidrio. Corte la punta distal de la micropipeta a un tamaño de poro adecuado para la cantidad de ADN que se va a inyectar. Utilice tijeras para cortar la carcasa superior sellada para reabrir un agujero, de dos centímetros y medio de diámetro, y colocar el huevo establemente debajo del microscopio estéreo.
Depositar unas gotas de la solución de PBS preparada en el huevo. Usando dos fórceps finos, despegue la membrana alantoica que cubre el embrión, teniendo cuidado de no causar una hemorragia. A continuación, retire el amnion de la cabeza del embrión.
Al girar la cabeza con una microspatula, utilice una micropipeta conectada a un tubo de aspiración, para inyectar entre 0,1 y un microlitro del ADN de color en la cavidad ventricular del tectum óptico izquierdo. Coloque un par de electrodos tipo fórceps alrededor del área objetivo del tectum óptico. Utilice el generador de pulsos para cargar un pulso previo de 30 voltios durante un milisegundo con un intervalo de cinco milisegundos, y para pulsos posteriores de seis voltios durante cinco milisegundos con un intervalo de 10 milisegundos.
Después de todo esto, sellar el agujero con cinta adhesiva, y continuar incubando a 38 grados Celsius y 70 por ciento de humedad relativa. Sumerja los electrodos en un plato de plástico lleno de PBS, y use un cepillo interdental para eliminar el albúmina. Repita el proceso desde el corte inicial de la cáscara hasta la electroporación para cada huevo.
Un día antes del Cultivo de Montaje Plano, comenzó a preparar el cultivo celular codificado Insert agregando autoclave al agua destilada a un plato de cultivo celular de 10 centímetros. Flotar algunos insertos de cultivo celular en el agua. En una solución que contiene ocho microgramos por mililitro de laminin, y 80 microgramos por mililitro Polly L, asegurándose de cubrir los insertos.
Incubar durante la noche a 37 grados centígrados en la incubadora de dióxido de carbono de cultivo celular. El día del cultivo en E7.0, se quitó la solución de laminina y poli l-lisina del inserto. A continuación, transfiera el Insert a un plato de fondo de vidrio lleno de 1,1 mililitro de medio de cultivo.
Transfiera el plato a la incubadora de dióxido de carbono de cultivo celular a 37 grados centígrados. Establezca una unidad de cámara húmeda en un microscopio confocal invertido con un flujo de gas de 40% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono, y una temperatura de 38 grados centígrados. Para comenzar a preparar una muestra de tejido en el Inserto, utilice fórceps para pellizcar la cabeza del embrión en un plato de cultivo celular de seis centímetros que contenga HBSS helado.
Utilice dos fórceps finos para aislar el tectum óptico electroporado. Y luego usa un gotero de plástico para transferirlo a un plato de vidrio cóncavo a base de silicio negro y lleno de HBSS helado. Compruebe la posición del etiquetado bajo microscopio estereoscópico fluorescente.
Con un cuchillo microquirúrgico, corte el tejido tectal que rodea el etiquetado mientras observa la dirección del tejido en el tectum. Después de esto, utilice un gotero de plástico para transferir el tejido etiquetado al inserto de modo que el lado del pasador esté unido al inserto. Poner el tejido tectal en la dirección deseada y eliminar cualquier exceso de HBSS.
Repita el proceso de preparación del tejido para cualquier otra muestra de tejido destinada al mismo inserto. A continuación, coloque el plato en la cámara preformada del microscopio confocal invertido. Con el microscopio confocal invertido, compruebe el etiquetado fluorescente y enfoque el campo microscópico.
Encienda la unidad confocal láser. Muestree la exploración confocal para ajustar la dirección y la posición del tejido a lo largo de los ejes x e y en el campo. A continuación, seleccione el tamaño de escaneado.
Decida el intervalo y el rango total del escaneo confocal a lo largo del eje z. Tome un intervalo de cinco o 10 micrómetros para el rango de 100 micrómetros. Elija el intervalo de tiempo de la imagen confocal y la duración total de la imagen.
Después de establecer los parámetros del programa en ejecución confocal, comience la toma de imágenes. Una vez completada la imagen, combine las imágenes confocales en un eje C diferente para producir imágenes de la pila z con el ajuste focal final en cada punto de tiempo. A continuación, añada las imágenes de la pila Z en diferentes puntos de tiempo para construir una película de lapso de tiempo.
En este estudio, la migración celular se detecta en capas superficiales a través de la electroporación en Ovo, el cultivo celular de montaje plano y la imagen confocal de lapso de tiempo. Las células que migran tangencialmente y los núcleos en las capas superficiales del tectum óptico se ven aquí cero horas, nueve horas, 18 horas y 27 horas después del inicio de la grabación. Una película de lapso de tiempo de intervalos de 10 minutos durante un período de 28 horas y 50 minutos, muestra el movimiento de masa de las células migratorias y sus núcleos.
La película combinada muestra claramente el movimiento de masa de las células migratorias. La direccionalidad de la migración celular se puede examinar centrándose en las celdas dispersas desde el centro etiquetado hasta todas las direcciones. Las imágenes claras del movimiento nuclear, permite el seguimiento automático de la migración nuclear utilizando un plugin de seguimiento de partículas.
Los cambios temporales de las trayectorias de la migración tangencial se pueden visualizar y demostrar que la migración de dispersión es omnidireccional. Las imágenes de mayor aumento se pueden tomar en intervalos de cinco minutos. Investigar el comportamiento celular individual con el cambio morfológico secuencial del proceso inicial, el proceso final y los núcleos.
Siguiendo este procedimiento, se puede realizar el etiquetado de acciones de iluminación. Con el fin de responder a preguntas adicionales como los mecanismos de la guía De Aksum.
