Bu yöntem, nöronal hücre göç mekanizmaları gibi gelişimbiyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, uzun vadede bireysel ve kolektif hücre göçlerini tespit edebiliyor olmaktır. Alkali lizis yöntemi ile bakteri kültürünün 200 mililitre izole sonra, iki plazmidler karıştırın, her biri son konsantrasyonu mikrolitre başına dört mikrogram olması gibi.
Verimli tavuk yumurtalarını %70 bağıl nemde 38 santigrat derecede yatay olarak kuluçkaya yatırın. İki buçuk gün sonra, yumurtanın sivri tarafından beş mililitre albumini ortadan kaldırmak için 18 gauge iğneli 20 mililitrelik bir şırınga kullanın. Deliği bantla kapatın.
Sonra, yumurta kabuğunun üst kesmek ve çapı iki santimetre, bir delik açmak için kavisli makas kullanın. Stereomikroskop altında, embriyonun gelişim evresini kontrol edin. Bu büyük deliği bantla kapatın.
Kuluçkaya 38 santigrat derecede ve yüzde 70 bağıl nemde E5.5'e kadar devam edin. Elektroporasyondan önce, 0,5 mikrolitre hızlı yeşil ile renkli plazmid DNA'sının 10 mikrolitresini hazırlayın. Ayrıca, penisilin mililitre başına 100 birim içeren otoklavps 10 mililitre hazırlamak ve streptomisin mililitre başına 100 mikrogram.
Cam kılcal tüplerden yapılmış mikropipetleri hazırlamak için bir mikropipet işlemci kullanın. Mikropipetin distal ucunu enjekte edilecek DNA miktarı için uygun bir gözenek boyutuna kesin. Bir delik, çapı iki buçuk santimetre yeniden açmak için mühürlü üst kabuk kesmek için makas kullanın ve stereo mikroskop altında yumurta stabil ayarlayın.
Hazırlanan PBS çözeltisinin birkaç damlasını yumurtanın içine yatırın. İki ince forceps kullanarak, embriyo kapsayan allantoik membran soyma, bir kanamaya neden olmamak için dikkatli olmak. Sonra embriyonun başından amnion çıkarın.
Bir microspatula ile baş dönerken, sol optik tectum ventriküler kavite içine renkli DNA 0.1 ve bir mikrolitre arasında enjekte etmek için, bir emme tüpüne bağlı bir mikropipet kullanın. Optik tectum hedef alanı etrafında forseps tipi elektrotlar bir çift yerleştirin. Beş milisaniyelik bir aralıkla bir milisaniye için 30 voltluk bir ön darbeyi şarj etmek için darbe jeneratörü kullanın ve 10 milisaniyelik bir aralıkla beş milisaniye boyunca altı voltluk sonraki darbeler için.
Tüm bunlardan sonra, bant ile delik mühür ve 38 derece santigrat ve yüzde 70 bağıl nem kuluçka devam edin. Elektrotları PBS ile dolu plastik bir tabağa batırın ve albumeni çıkarmak için interdental fırça kullanın. Her yumurta için elektroporasyon için ilk kabuk kesme işlemi tekrarlayın.
Bir gün önce Flat-Mount Kültür, 10 santimetre hücre kültür çanak distile su için otoklav ekleyerek kodlanmış hücre kültürü Insert hazırlamaya başladı. Float bazı hücre kültürü su ekler ekler. Mililitre laminin başına sekiz mikrogram ve mililitre Polly L başına 80 mikrogram içeren bir çözeltide, Kesici Uçları kapsayacak şekilde emin olun.
Hücre kültüründe karbondioksit inkübatörde bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. E7.0'daki kültür gününde, Ekle'deki laminin ve poli l-lizin çözeltisi çıkarıldı. Daha sonra, Ekle'yi 1,1 mililitre kültür ortamıyla dolu cam tabanlı bir tabağa aktarın.
Yemeği hücre kültürüne 37 derecede karbondioksit kuvöze aktarın. %40 oksijen ve %5 karbondioksit ve 38 santigrat derece lik bir sıcaklıkla ters bir konfokal mikroskobun üzerine nemli bir oda ünitesi ayarlayın. Insert üzerinde bir doku örneği hazırlamaya başlamak için, buz gibi HBSS içeren altı santimetrelik hücre kültür çanak içine embriyo kafa çimdik için forceps kullanın.
Elektroporated optik tectum izole etmek için iki ince forceps kullanın. Ve sonra siyah silikon ile dayalı ve buz gibi HBSS ile dolu bir içbükey cam çanak içine aktarmak için plastik bir damlalık kullanın. Floresan stereoskopik mikroskop altında etiketlemekonumunu kontrol edin.
Bir mikro cerrahi bıçak kullanarak, tektumdoku yönünü belirterek etiketleme çevreleyen tectal doku kesip. Bundan sonra, pin tarafı Ekleme'ye bağlı olacak şekilde etiketli dokuyu Insert'e aktarmak için plastik bir damlalık kullanın. Tectal dokuyu istenilen yöne doğru yatırın ve fazla HBSS'yi çıkarın.
Aynı Kesici Uç için tasarlanmış diğer doku örnekleri için doku hazırlama işlemini tekrarlayın. Daha sonra kabı ters konfokal mikroskobunun önceden oluşturulmuş odasına yerleştirin. Ters konfokal mikroskobu kullanarak floresan etiketlemeyi kontrol edin ve mikroskobik alana odaklanın.
Lazer konfokal ünitesini çalıştırın. Alandaki x ve y eksenleri boyunca dokunun yönünü ve konumunu ayarlamak için konfokal tonu örnek alın. Ardından, tarama boyutunu seçin.
Z ekseni boyunca konfokal scan aralığı ve toplam aralığı karar verin. 100 mikrometre aralığı için beş veya 10 mikrometre lik bir aralık alın. Konfokal görüntülemenin zaman aralığını ve toplam görüntüleme süresini seçin.
Konfokal çalışma programının parametrelerini ayarladıktan sonra görüntülemeye başlayın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, her zaman noktasında son odak ayarı ile z-yığın görüntüleri üretmek için farklı bir C ekseninde konfokal görüntüleri birleştirir. Daha sonra z yığını görüntülerini farklı zaman noktalarında ekerek hızlandırılmış bir film yapın.
Bu çalışmada Ovo'da elektroporasyon, düz monte hücre kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme ile yüzeysel tabakalarda hücre göçü saptanmıştır. Teğet göç eden hücreler ve optik tectum yüzeysel katmanlarındaki çekirdekler burada sıfır saat, dokuz saat, 18 saat ve kayıt başlangıcından 27 saat sonra görülür. 28 saat 50 dakikalık bir süre içinde 10 dakikalık aralıklarla bir zaman atlamalı film, göç eden hücrelerin ve çekirdeklerinin kütle hareketini gösterir.
Birleştirilmiş film açıkça göç hücrelerinin kitle hareketini gösterir. Hücre geçişinin yönü, etiketli merkezden her yöne dağılan hücrelere odaklanılarak incelenebilir. Nükleer hareketin net görüntüleri, bir parçacık izleme eklentisi kullanarak nükleer göç otomatik izleme sağlar.
Teğetsel göçün yörüngelerinin zamansal değişimleri görselleştirilebilir ve dağılan göçün çok yönlü olduğunu kanıtlayabilir. Daha yüksek büyütme görüntüleri beş dakikalık aralıklarla alınabilir. Önde gelen sürecin, izleme sürecinin ve çekirdeklerin sıralı morfolojik değişimi ile bireysel hücre davranışını araştırmak.
Bu yordamı takiben, aydınlatıcı eylemlerin etiketleme yapılabilir. Aksum rehberlik mekanizmaları gibi ek sorulara cevap vermek için.
