이 방법은 신경 세포 이동의 기계장치와 같은 발달 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장기적으로 개인 및 집단 세포 이동을 감지할 수 있다는 것입니다. 알칼리성 리시스 방법에 의해 세균 배양 200밀리리터를 분리한 후, 각각의 최종 농도가 마이크로리터당 4마이크로그램인 두 플라스미드를 혼합한다.
비옥한 닭고기 알을 상대 습도 70%에서 섭씨 38도에서 수평으로 배양합니다. 2일 반 후에는 18게이지 바늘이 달린 20밀리리터 주사기를 사용하여 달걀의 뾰족한 면에서 5밀리리터의 알부민을 제거하십시오. 테이프로 구멍을 밀봉합니다.
다음으로 곡선 가위를 사용하여 달걀 껍질의 상단을 자르고 직경 2센티미터의 구멍을 엽니다. 스테레오 현미경에서, 배아의 발달 단계를 확인. 테이프로 이 더 큰 구멍을 밀봉합니다.
E5.5까지 섭씨 38도, 상대 습도 70%로 인큐베이션을 계속합니다. 전기화 전에, 빠른 녹색의 0.5 마이크로 리터로 착색 언급 된 플라스미드 DNA의 10 마이크로 리터를 준비합니다. 또한 페니실린 밀리리터당 100유닛을 함유한 오토클레이브 PBS 10밀리리터와 연쇄상 구균의 밀리리터당 100마이크로그램을 준비합니다.
마이크로피펫 프로세서를 사용하여 유리 모세관 튜브로 만든 마이크로 피펫을 준비합니다. 주입될 DNA의 양을 위해 마이크로피펫의 탈실 팁을 적절한 모공 크기로 자른다. 가위를 사용하여 밀봉 된 상단 껍질을 잘라 직경2 센티미터 반의 구멍을 다시 열고 스테레오 현미경 아래에 달걀을 비설시놓습니다.
준비된 PBS 용액 몇 방울을 계란에 보관하십시오. 두 개의 미세 한 집게를 사용 하 여, 배아를 덮고 있는 알란토믹 멤브레인을 벗겨, 출혈을 일으키지 않도록 주의. 그런 다음 배아의 머리에서 양수절단을 제거합니다.
현미경으로 머리를 돌리는 동안 흡입 튜브에 연결된 마이크로 파이프를 사용하여 왼쪽 광학 텍텀의 심실 구멍에 착색 된 DNA의 0.1과 마이크로 리터를 주입하십시오. 시공간의 대상 영역에 한 쌍의 집게 형 전극을 놓습니다. 펄스 생성기를 사용하여 5밀리초 간격으로 1밀리초 동안 30볼트의 프리 펄스를 충전하고, 10밀리초 간격으로 5밀리초 동안 6볼트의 후속 펄스를 충전합니다.
이 모든 후, 테이프로 구멍을 밀봉하고 섭씨 38도및 상대 습도 70 %에서 인큐베이팅을 계속합니다. 전극을 PBS로 채워진 플라스틱 접시에 담그고 치과 간 브러시를 사용하여 알부민을 제거합니다. 각 계란에 대한 전기 기화에 초기 껍질 절단에서 과정을 반복합니다.
플랫 마운트 배양 하루 전에 10센티미터 세포 배양 접시에 증류수에 오토클레이브를 추가하여 코딩된 세포 배양 삽입을 준비하기 시작했습니다. 물에 일부 세포 배양 삽입을 플로트. 밀리리터 라미닌 당 8 마이크로 그램을 포함하는 용액에서, 그리고 밀리리터 폴리 L 당 80 마이크로 그램, 삽입을 커버해야합니다.
세포 배양 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. E7.0에서 문화의 날에, 삽입에서 라미닌 및 폴리 l-리신 용액을 제거. 그런 다음 인서트를 배양 배지의 1.1 밀리리터로 채워진 유리 바닥 접시로 옮는다.
37°C의 세포 배양 이산화탄소 인큐베이터로 접시를 옮기. 40%의 산소와 5%의 이산화탄소, 그리고 섭씨 38도의 온도로 역구된 공초점 현미경에 습한 챔버 유닛을 설정합니다. 삽입에 조직 견본을 준비하는 것을 시작하려면, 얼음 감기 HBSS를 포함하는 6 센티미터 세포 배양 접시로 배아 머리를 꼬집어 집게를 이용하십시오.
두 개의 미세 한 집게를 사용하여 전기 화 된 광학 텍텀을 분리하십시오. 그런 다음 플라스틱 드롭퍼를 사용하여 검은 색 실리콘을 기반으로 얼음처럼 차가운 HBSS로 채워진 오목한 유리 접시로 옮춥습니다. 형광 입체 현미경에서 라벨의 위치를 확인합니다.
마이크로 외과 칼을 사용하여, 텍텀에 있는 조직의 방향을 주의하는 동안 라벨을 둘러싼 tectal 조직을 잘라냅니다. 그런 다음 플라스틱 드롭퍼를 사용하여 표지된 조직을 인서치로 전송하여 핀 측이 삽입에 부착되도록 합니다. 텍탈 조직을 원하는 방향으로 놓고 과도한 HBSS를 제거합니다.
동일한 삽입을 위한 다른 조직 샘플에 대한 조직 준비 과정을 반복한다. 그런 다음 반전된 공초점 현미경의 미리 형성된 챔버에 접시를 놓습니다. 반전된 공초점 현미경을 사용하여 형광 라벨링을 확인하고 현미경 필드에 초점을 맞춥니다.
레이저 공초점 장치를 시작합니다. 현장에서 x 및 y 축을 따라 조직의 방향과 위치를 조정하기 위해 공초점 스캔을 샘플링합니다. 다음으로 스캔 크기를 선택합니다.
z축을 따라 공초점 스캔의 간격 과 총 범위를 결정합니다. 100 마이크로미터 범위에 대해 5 또는 10 마이크로미터의 간격을 취하십시오. 공초점 이미징의 시간 간격과 전체 이미징 지속 시간을 선택합니다.
공초점 실행 프로그램의 매개 변수를 설정한 후 이미징을 시작합니다. 이미징이 완료되면 다른 C 축의 공초점 이미지를 결합하여 매 지점에서 최종 초점 조정을 통해 z 스택 이미지를 생성합니다. 그런 다음 서로 다른 시간에 Z 스택 이미지를 추가하여 시간 경과 동영상을 생성합니다.
이 연구에서는, 세포 이동은 오보의 전기화, 평평한 마운트 세포 배양 및 시간 경과 공초점 이미징을 통해 피상층에서 검출됩니다. 접선 이동 세포와 광학 텍텀의 피상적 층에서 핵은 여기서 제로 시간, 9시간, 18시간 및 기록 개시 후 27시간 후에 볼 수 있다. 28 시간 50 분 기간 동안 10 분 간격의 시간 경과 영화는, 이주 세포와 그들의 핵의 질량 움직임을 보여줍니다.
병합된 동영상은 마이그레이션 셀의 질량 이동을 명확하게 보여줍니다. 세포 이동의 방향성은 표지된 중앙에서 모든 방향으로 분산 세포에 초점을 맞추어 검사될 수 있다. 핵 무브먼트의 선명한 이미지는 입자 추적 플러그인을 사용하여 핵 마이그레이션을 자동으로 추적할 수 있게 해줍니다.
접선 이동의 궤적 궤적의 시간적 변화는 시각화될 수 있으며 분산 마이그레이션이 전방향임을 증명할 수 있습니다. 배율이 높은 이미지는 5분 간격으로 촬영할 수 있습니다. 선행 과정, 후행 공정 및 핵의 순차적 형태학적 변화를 통해 개별 세포 거동을 조사한다.
이 절차에 따라 조명 작업의 레이블을 수행할 수 있습니다. Aksum 지침의 메커니즘과 같은 추가 질문에 답하기 위해.
