Этот метод может помочь классифицировать нейронные подтипы и расширить наше понимание функциональной карты корковых схем. Этот протокол был оптимизирован для сохранения ультраструктуры нейронов и получить отличное восстановление как дендритных, так и аксональных беседок, что позволяет высококачественные реконструкции. В конце электрофизиологической записи перенесите ломтик, содержащий записанную клетку, в небольшое блюдо ACSF.
Во время работы в дым капот, рулон ломтик на небольшой кусок тонкого качества фильтровальной бумаги и место еще один кусок увлажненной фильтровальной бумаги на ломтик. Поместите ткань в небольшой пластиковый горшок, содержащий от 5 до 10 миллилитров фиксаторного раствора и хранить при четырех градусах Цельсия на ночь. На следующий день перенесите ткань из контейнера с фиксаторным раствором в контейнер с двумя миллилитров 0,1 молярного фосфатного буфера для полоскания и отрежьте излишки ткани скальпелем лезвием.
Удалить избыток ткани, поместив ломтик в чашку Петри, и отрезать избыток ткани скальпелем лезвие. Перенесите обрезанную ткань в чистую чашку Петри, гарантируя, что она лежит ровной без складок или складок. Удалите лишний буфер с помощью сухой кисти краски.
Накройте ткань теплым раствором желатина и поместите чашку Петри на замороженный блок, чтобы быстро охладить раствор. Затем переместите блюдо установки желатина до 4 градусов по Цельсию в течение 30 до 60 минут. В дымовой капот, использовать лезвие скальпеля, чтобы вырезать небольшой, 1 X 1 сантиметр блок, содержащий желатин встроенной ткани.
Поднимите блок с помощью небольшого шпателя и тщательно перенесите на свежий фиксативный раствор. Разрешить исправить, по крайней мере 30 минут при четырех градусах по Цельсию. После этой второй фиксации, мыть желатин блок в пять миллилитров ПБ в три раза.
После мытья высушите блок с помощью листка бумажной ткани. Затем используйте небольшое количество цианоакрилатного клея, чтобы приклеить блок, ориентированный с тканью в верхней части, на вибромный грузовик с помощью супер клея. Раздел ломтик на 50 микрон толщиной с помощью вибромы и поместите каждый раздел тщательно в стеклянный флакон, содержащий 10 процентов сахарозы.
После секционирования, тщательно возьмите секцию из флакона и поместите его плоским в крышку чашки Петри. Затем используйте свежее лезвие скальпеля, чтобы удалить желатин со всего раздела. Поместите секции во флакон, содержащий 2 миллилитров свежей 10 процентов сахарозы в ПБ, и агитировать в течение 10 минут, чтобы начать процесс криопротекторной.
После криозащиты поместите секции плоскими на небольшой прямоугольник алюминиевой фольги с помощью кисти. Удалите излишки жидкости из секций и аккуратно сложите фольгу в посылку. Держите алюминиевую фольгу близко к поверхности жидкого азота, не касаясь поверхности в течение 30 секунд.
А затем позволить разделам оттаять полностью в течение примерно 30 секунд. Повторите заморозку оттепели еще два раза. Удалите все секции из фольги с кистью и поместите их в стеклянный флакон, содержащий два миллилитров ПБ, чтобы смыть избыток сахарозы под постоянным возбуждением.
После иммуностения для флуоресценции изображений, поместите слайд в стеклянную чашку Петри, содержащую PBS, и тщательно удалите крышку скольжения. Затем смойте секции со слайда с помощью нежных импульсов PBS из пипетки Pasteur. Поместите секции в чистый стеклянный флакон, содержащий PBS.
Выполните avidin HRP реакции, сначала инкубации разделов в Avidin биотин комплекса или ABC, по крайней мере два часа, чтобы усилить продукт реакции HRP. Далее, мыть разделы с PBS 3 раза в течение 10 минут, а затем с трис буфера дважды в течение 10 минут. После удаления последнего tris буфер мыть, быстро добавить одну каплю восемь процентов никеля хлорид решение diaminobenzidine решение или DAB решение.
Затем пипетка раствор в и из, чтобы смешать и быстро добавить один миллилитр этого решения по разделам. Инкубировать разделы в этом решении в течение 15 минут. Затем добавьте 10 микролитров 1 процента перекиси водорода в раствор DAB.
Разрешить реакцию, чтобы продолжить в темноте под постоянным возбуждением в течение примерно одной-двух минут, пока клетки помечены. В дымовой капот поместите небольшой круг фильтровальной бумаги в чашку Петри и смочите ее ПБ. Поднимите секции по одному из стеклянного флакона с помощью кисти краски и аккуратно поместите их плашмя на бумагу. Обложка разделов с другой увлажненный круг фильтровальной бумаги и удалить избыток буфера, мягко касаясь бумаги ткани на поверхность.
Нанесите восемь или девять капель одного процента осмия тетроксида в ПБ на верхнюю бумагу. Накройте блюдо и сохраняем в дымовом капюшоне не менее 30 минут, но не более 1 часа. После полоскания, монтажа и обложек секций, обезвоживание через ряд 50 процентов, 70 процентов, 95 процентов, и 100 процентов алкогольных растворов.
После шага обезвоживания перенесите секции на стеклянный флакон, содержащий 100-процентный этанол на шейкере в течение примерно пяти минут. Замените спиртовой раствор оксидом пропилена и промойте три раза в течение пяти минут. После последней стирки, держать около двух миллилитров оксида пропилена во флаконе и добавить смолы в соотношении 1:1.
Убедитесь, что смола растворяется и держать секции под постоянным возбуждением в течение 30 минут. Через 30 минут используйте деревянную палку, чтобы поместить каждый раздел в алюминиевый планхетт, содержащий эпоксидную смолу, и инкубировать на ночь. На следующий день поместите планчет на горячую тарелку примерно на 10 минут.
Затем возьмите каждый раздел с деревянной палкой и поместите на чистую горку. После того, как все секции были перенесены на слайд, просмотрите слайд под рассечением микроскопа, чтобы проверить ориентацию ломтиков и поместите крышку над секциями. Лечить в духовке в течение 48 часов при температуре 56 градусов по Цельсию.
Используйте цель низкого увеличения, чтобы сосредоточиться на домашней секции, содержащей тело клетки. Затем используйте цель 100x, сосредоточьтесь на клеточном теле и нажмите в центре, чтобы отметить точку отсчета. Чтобы проследить сому в 3D с помощью 100x цели, выберите контур из вкладки трассировки и выберите контур тела клетки.
Используйте джойстик, чтобы переместить фокус на самый верх клеточного тела. Поместите точки, нажав по периметру части, которая в настоящее время находится в фокусе. Нажмите правой кнопкой мыши и выберите близкий контур, чтобы закончить этот первый контур.
Повторите этот процесс в разных положениях z до тех пор, пока дно тела клетки не будет достигнуто. Чтобы проследить дендритную беседку, выберите дендрит или апический дендрит, в меню нейронов. Во-первых, проследите короткий начальный сегмент для каждого дендрита с помощью колеса прокрутки мыши, чтобы настроить диаметр курсора, чтобы соответствовать диаметру дендрита.
След вдоль каждого дендрита. Когда узел в дереве достигнут, нажмите правой кнопкой мыши и выберите раздвояющий узел или трифуркативный узел из меню высадки. Чтобы определить соответствующие точки между дендритами в разделе, который соответствует завершенной секции, нажмите на вкладку перемещения и выберите точки соответствия.
Выберите количество очков, необходимых для совпадают, а затем нажмите OK. Нажмите на окончание завершенной ветки, а затем нажмите на ветку. Повторите это для каждой точки матча. После того, как все дендриты каждого раздела были прослежены, проследить аксон с помощью того же процесса Показано здесь является реконструкция ячейки корзины CA2 с ограниченным дендритных и аксональных беседка с помощью рисования трубки.
Дендриты в черном, а аксон в красном. Это пример изображения биоцитина заполнены корзины ячейки после Avidin HRP протокол описано здесь. Здесь показано видео 3D нейронной реконструкции ячейки корзины CA2.
Дендриты в темно-розовом цвете, а аксон в белом. Наконец, на этом изображении показана дендрограмма ячейки корзины CA2. Это займет время, чтобы стать опытным с этим протоколом.
Тем не менее, этот оптимизированный подход может генерировать изображения высокого разрешения сложных корковых и гиппокамповых структур in-vitro.
