Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать, как объединить использование микрофлюзики с микро электродными массивами для создания платформы, пригодной для изучения нейрональной связи и распространения аксонального сигнала. Здравствуйте, я Пауло Агиар, и я PI нейро-инженерии и вычислительной нейронауки лаборатории INEB, используется для кода для биомедицинской инженерии в Университете Порту, Португалия. Понимание передачи информации в нейро схемах остается одной из самых больших проблем в неврологии.
Сегодня я покажу вам, как мы можем объединить отдельные массивы микроактуаторов с микрожидкой жидкостью и программными инструментами, разработанными здесь, в нашей лаборатории, для обнаружения и характеристики распространяющихся потенциалов действий. Мы используем эту установку в различных исследованиях, а именно нейронного кодирования и декодирования, а также в связи между сенсорными нейронами и другими типами клеток. Мы считаем, что визуальная демонстрация этого протокола имеет решающее значение.
Поскольку сборка микрожидкых и микроэлектроразделов является трудностью в управлении и трудно воспроизвести только путем воспроизведения протоколов. Для рынка культовые продажи на этой платформе не просты, как обычные ABAs, и это требует особого внимания к ячейке сидя вещи, и культуры магнитов. Эта настройка позволяет нам изучать несколько связанных с коммуникацией свойств, таких как скорость распространения и направление, в хорошо контролируемой среде.
Хотя процедура записи проста, анализ данных требует знаний и использования правильных вычислительных инструментов. За день до заседания клетки начните с подготовки микрожидких устройств, очистите виниловой лентой. Аккуратно прижимайте ленту к устройству, чтобы достичь всех областей микрожидкой жидкости.
Воздушная плазма очищает MEA в течение трех минут, чтобы очистить поверхность и сделать ее более гидрофильной. Внутри ламинарного потока капот, погрузить микро жидкости в 70 процентов этанола. Дайте им высохнуть.
Поместите каждый MEA в чашку Петри, и стерилизовать на 15 минут воздействия УФ-излучения. Затем отправляйтесь в центральную область МЭА с 500 микролитров решения PEI. Инкубировать в течение по крайней мере одного часа.
Внутри ламинарного потока капот, аспирировать PEI покрытие раствор с поверхности MEA. Затем, мыть MEAs четыре раза с одним миллилитр стерильной воды. С помощью стерильного микроскопа, помещенного внутрь ламинарного капюшона потока.
Центр MEA чип, и добавить один миллилитр стерильной воды в центральной области MEA. Далее поместите микрожидкое устройство поверх поверхности МЕА и тщательно выровняйте микрогровую микро-активную сетку МЕА. Аспирировать чрезмерную воду, и инкубировать на ночь при 37 градусах, чтобы обеспечить полное вложение.
На следующий день загрузите колодцы ламинином и снова инкубировать. После сбора эмбрион susseds, приступить к префронтальной рассечения коры. Начните с тщательного разоблачения мозга, используя пару типсов.
Затем аккуратно удалить мозг из его полости. Обложка его с холодным H-HBSS. При присутствовали, удалить и отказаться от обонятельных луковиц.
Наконец, вскрыть префронтальной коры. Обеспечить полное удаление опола. Повторите эту процедуру для обоих полушарий.
Для количества мозгов, необходимых для вашего исследования. Внутри капота ламинарного потока соберите фрагменты коры, ранее расчлененные в общей сложности в пяти миллилитров H-HBSS. Затем перенесите эти фрагменты в стерильную 15 миллилитровую хроническую трубку.
Pipette, и 2,3 миллилитров свежеприготовленного трипсина раствор трубки, содержащей фрагменты коры. Смешайте подвеску и инкубировать при 37 градусах в течение 15 минут. Агитировать каждые пять минут.
Затем отбросьте супернатант, содержащий трипсин, добавьте H-HBSS, содержащий FBS, чтобы инактивировать оставшийся трипсин. Аккуратно агитировать. Пусть фрагменты коры оседают, и отказаться от супернатанта.
Вымойте два раза с H-HBSS, чтобы удалить FBS, и отказаться от супернатанта снова. Добавить дополненную нейронную базальную среду и механически разобщить ткани, медленно трубя вверх и вниз. Откажитесь от оставшейся ткани, фильтруя соленую суспензию через клеточный ситечко.
Затем смешайте 20 микролитров клеточной подвески с 20 микролитров трипан-синего цвета. Перенесите 10 микролитров в камеру Нойбауэра и подсчитайте количество жизнеспособных клеток. Непосредственно перед сидением клетки удалите ламинин из всех колодцев микро EF. Затем добавьте небольшой объем сверхнатантной среды к каждому колодец аксонального отсека.
Медленно посеять пять микролитров клеточной подвески в сомальный отсек. Инкубировать при 37 градусах в течение одного часа, чтобы клеточная привязанность к субстрату. Через час аккуратно заполните каждый колодец теплой дополненной средой.
Добавьте небольшие объемы, чтобы избежать отслоения клеток. Затем перенесите микро EF в инкубатор. Здесь показана культура на пять дней в пробирке.
Через неделю культуры начинают проявлять спонтанную активность. Перед выполнением записей, используйте контроллер температуры, чтобы съесть предварительно усилитель пожарной базы пластины. Затем поместите микро EF на преамплификатор, а затем закройте и защелкой крышку.
Для записи откройте многоканайное экспериментальное программное обеспечение. Установите скорость отбора проб до 20 килогерц. Перетащите фильтр и записанные коробки, и подключите их последовательно для записи как необработанных, так и фильтрованных данных.
Начните сбор данных, чтобы визуализировать сигналы и быстро записывать. Записанные данные можно быстро изучить с помощью многоканарового анализатора. Здесь распространение сигнала вдоль микрогров уже ясно.
Чтобы выявить и охарактеризовать эти события распространения, откройте запись в микро-охотнике за шипами. Нажмите кнопку информации о файле, чтобы получить доступ к настройкам записи, и выберите набор микро-электродов для анализа. Установите порог для распространения обнаружения событий.
И быстро читать данные. Программное обеспечение будет перечислять все обнаруженные последовательности. Пользователь может оценить скорость распространения как информацию, между парами микроэлектроприем, и на основе их между расстоянием и перекрестной корреляции.
Инструмент химио-графа позволяет пользователю вручную оценить скорость распространения. Здесь показано распространяемое событие. Обнаружено вдоль четырех микроэлектродов в микроросле.
Эти события могут быть представлены в сюжете Rasser. Вот распространяющаяся активность по 11 микросхемам за первые две минуты записи. Микрогровы высокой и низкой активности окрашены в желтый и красный цвета, с уважением.
Обратите внимание на синхронизацию активности вдоль 11 микрогров. Синхронизация не зависит от скорости активности. Как видно из вариаций мгновенной скорости стрельбы двух микрогров.
Микрогров также функционируют как аксональные усилители сигнала, как показано на участке коробки и усов. Мы показали вам, как сочетать микрофлекотики с MEAs, и как культура нейронов на них. Кроме того, как записывать и извлекать значимые данные из этих записей.
Мы надеемся, что эта демонстрация будет полезна для ваших исследований, почему вы, возможно, хотели изучить связь в нейронных цепях.
