Митохондрии необходимы для здоровья нейронов. При многих нейродегенеративных заболеваниях первыми страдают аксональные митохондрии, но неясно, что делает аксональные митохондрии такими особенными. Градиент жидкостного давления в камерах, используемых в этом протоколе, позволяет проводить селективную обработку аксонов митохондрий.
Это оставляет процессы клеточного тела нетронутыми и позволяет нам сосредоточиться на аксональной биологии. Мы показываем здесь деполяризацию митохондрий с помощью мембранно-потенциально чувствительного красителя, но этот метод может быть применен ко многим различным типам нейронных клеток и флуоресцентным показаниям. Для начала поместите закодированные шесть плит скважины в стерильный вытяжку и дважды промыть их стерильной двойной дистиллированной водой.
Дайте тарелкам высохнуть в наклонном положении в течение трех-пяти минут. Удалите лишнюю воду вакуумным всасыванием или пипеткой. Затем замочите микрофлюидную камеру в 80% этаноле.
Опять же, высушите микрофлюидную камеру в течение трех-пяти минут в наклонном положении и удалите избыток этанола кончиком пипетки. Когда полностью высохнет, поместите микрофлюидную камеру в центр лунки и пластину. Осторожно постучите по микрофлюидной камере по ее границам и микрогрузовой секции посередине для правильного крепления к стеклянной пластине.
Во-первых, соберите нужное количество диссоциированных нейронов гиппокампа в реакционную трубку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте трубку в 1000 раз G в течение четырех минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в восьми микролитрах нейробазальной среды B-27.
Затем дозируют клеточный раствор в канал входа микрофлюидной камеры. Нажмите на заднюю часть пластины, чтобы помочь потоку через канал. Используя пипетку, аспирируйте любую оставшуюся клеточную суспензию на выходе из канала.
Инкубируйте микрофлюидную камеру с клетками в течение 15-20 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Затем заполните верхний аксональный колодец 50 микролитрами нейробазальной среды B-27 и нажмите на заднюю часть пластины, чтобы помочь потоку. Заполните каждую лунку на стороне сомы 150 микролитрами нейробазальной среды B-27, создав пузырь напряжения сверху.
Также заполните обе лунки аксональной стороны 100 микролитрами нейробазальных сред B-27 каждая. После семи-восьми дней посева in vitro убедитесь, что аксоны выросли через микрорезы и распространились в аксональный компартмент. Промыть устройство, удалив нейробазальную среду B-27 и добавив 100 микролитров предварительно нагретой среды визуализации в верхние колодцы аксонального и сомового каналов.
Пусть среда течет в нижние скважины. Удалите среду из нижних скважин и любую оставшуюся среду из верхних скважин и повторите со свежей средой, оставив колодцы пустыми в конце промывки. Затем добавьте 100 микролитров пяти наномолярных разбавлений TMRE как в соматическую, так и в аксональную верхние скважины.
Пусть среда течет через оба отсека, пока во всех скважинах не будет равного объема. Заполните TMRE, содержащий среду. Выберите интересующую область в соматическом отсеке и проследуйте за ней через микропараты в аксональный отсек.
Убедитесь, что микробороздки, изображенные в соматическом и аксональном отсеках, подобраны друг к другу. После изменения имени файла получите красные флуоресцентные изображения, используя 561 нанометр возбуждения и 625 нанометров излучения длины волны. Обеспечьте разницу в объеме между камерами сомы и аксонами, проверив наличие пузырька натяжения на соматической стороне.
Затем удалите среду визуализации из обеих скважин аксональной стороны, за исключением среды внутри канала. Чтобы индуцировать деполяризацию митохондрий, добавьте 160 микролитров 20 микромолярного антимицина А, разбавленного в среде визуализации, к верхнему аксональному колодцу. Пусть он течет по каналу до тех пор, пока в обеих аксональных скважинах не будет равного объема.
Повторите визуализацию, убедившись, что изображены те же положения, что и во время базового сбора, путем идентификации микрорезов. Используя этот протокол, первичные нейроны гиппокампа были выращены в микрофлюидных устройствах с последующим окрашиванием митохондрий чувствительным к мембране красителем TMRE. Гомогенное окрашивание митохондрий наблюдалось с обеих сторон микрорезов, но не посередине.
При добавлении антимицина А к аксональной стороне сомальные митохондрии сохраняли сигнал TMRE, тогда как флуоресценция была потеряна из аксональных митохондрий Убедитесь, что в колодце или на устройстве не осталось влаги перед сборкой устройства. В противном случае камеры не будут опечатаны. Используя этот метод, мы можем изучить последствия потери митохондриальной функции в аксоне и локальных функций, а также ее влияние на ретроградную передачу сигналов и глобальное выживание клеток.
Долгое время считалось, что митохондриальный биогенез происходит исключительно в клеточном теле. Этот метод позволил выявить, что повреждение аксональных митохондрий требовало локальной трансляции короткого белка PINK1.
