Pseudomonas aeruginosa является патогеном уровня BSL-2. Не забудьте следовать всем практикам безопасности уровня BSL-2 при обращении с этим организмом. Здесь мы продемонстрируем первичную изоляцию клеток, в пробирке фагоцитоз, и фагоцитатический анализ пути, и виво фагоцитоз и бактериальный клиренс оценки у мышей.
Успешная внутритрахальная доставка требует практики освоения. Убедитесь, что микросхема загружается должным образом, игла находится между двумя вокальными складками, и скорость поршеня правильно контролируется. Начните с обеспечения мыши в положении на спине с конечностями распространения на доска для вскрытия покрыты бумажными полотенцами и зацепив строку под передними зубами, чтобы втянуть голову так, что трахея расположена прямо и уровне.
Дезинфицировать мышь с 70% этанола и использовать регулярные миппы, чтобы подтянуть кожу в центральной линии тела. Используйте хирургические ножницы, чтобы сократить кожу от живота до верхней части горла. Используйте тупой конец стандартных хирургических ножниц, чтобы тщательно вскрыть мышцы горла и соединительной ткани.
Откройте брюшную стенку под грудной клеткой. Вырезать диафрагму, и отрезать нижнюю часть грудной клетки, чтобы частично подвергать легких. Используйте весенние ножницы, чтобы разоблачить трахею и использовать типсы, чтобы схватить кольцо хряща.
Используйте микро ножницы, чтобы тщательно сделать примерно 1,5-миллиметровый разрез на брюшной стороне трахеи. Тщательно строки короткую длину швовой нити под трахеей и вставить 18 калибровочных канюли в трахею. Когда канюла на месте, осторожно лавировать легких три раза с одним миллилитр свежего PBS за стирку, осторожно снятия жидкости в шприц, прежде чем перелив его обратно в легкое в течение трех раз подряд.
После каждого лаважа перенесите собранную бронхоалвеолярную жидкость для лаважа или BALF в 15-миллилитровую коническую трубку для центрифугации общей собранной жидкости. Resuspend гранулы в один миллилитр свежих PBS для второй центрифугации и повторно промывают промывают альвеолярные макрофаги в два миллилитров Dulbecco модифицированных орлов среднего или DMEM дополнены 10% не-тепло-инактивированной сыворотки плода крупного рогатого скота. Затем перенесите первичные альвеолярные макрофаги в стеклянную чашку Петри для их двухдневной культуры при 37 градусах Цельсия в клеточном инкубаторе.
После 48 часов, мыть культуру с одним миллилитров PBS перед кормлением культуры с двумя миллилитров свежей среды. Затем добавьте в культуру карбоксилированные латексные бусины диаметром 50 двух микрометров FITC на клетку для одночасовой инкубации при 37 градусах Цельсия в клеточном инкубаторе. В конце инкубации, мыть пластину широко пять раз с одним миллилитр свежего PBS за стирку, чтобы удалить внеклеточные бусы и случайным образом изображение 100 клеток для подсчета клеток, содержащих внутриклеточные бусы.
Для анализа опоясывания, инкубировать два раза от 10 до восьмой овец красных кровяных телец или SRBCs с 50 микролитров кролика анти-SRBC иммуноглобулин M или IgM в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем инкубировать опсонизированных SRBCs с 50 микролитров C5-дефицит человеческой сыворотки в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, чтобы исправить C3b и C3b ингибитор дополняют фрагменты на IgM покрытием SRBCs. Далее, аспирировать средства массовой информации и добавить 100 микролитров один раз 10 до семи опсонизированных SRBCs на миллилитр среды к каждому хорошо 96-хорошо пластины, содержащей один раз 10 до четвертого ночных культурных макрофагов мурина на колодец.
Инкубировать SRBC мыши макрофаг кокультуры в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию, а затем удалить несъединый SRBCs путем мытья с 100 микролитров хлорида аммония хлорид калия лиза буфера в течение одной минуты. После того, как неприсоенные SRBCs были удалены, промыть 100 микролитров средств массовой информации. Lyse оставшихся клеток с 0,1% додекилового сульфата натрия и лечения лизатов с 50 микролитров 2, 7-диаминофторен дополнен 3%перекиси водорода и шесть молярной мочевины.
Затем измерьте абсорбцию гемоглобина-катализа фтора синего образования на спектрофотометре на 620 нанометров. Используйте стандартную кривую на значениях абсорбций 620 нанометров с известным числом SRBCs, чтобы определить количество опсонизированных SRBCs, которые фагоцитизированы. Для оценки распознавания рецепторов опосредованного фагоцитоза, мыть два дня культурных мыши первичных альвеолярных макрофагов с одним миллилитром PBS и лечения клеток с 500 микролитров свежей среды, содержащей 100 Alexa fluor-488 конъюгированных зимозан-биочастиц.
После одного часа при 37 градусах по Цельсию, арест фагоцитоза с 500 микролитров ледяной PBS и мыть клетки широко пять раз с одним миллилитров PBS за стирку. После последней стирки, исправить клетки с 4%paraformaldehyde в течение 10 минут при комнатной температуре и мыть клетки еще пять раз, как попродемонстрировано. После последней стирки накройте клетки 500 микролитров свежего PBS для визуализации под дифференциальным интерференционным контрастом и флуоресцентным каналом на 488 нанометров для количественной оценки количества ymosan-A-биочастицсодержащих альвеолярных макрофагов.
Для оценки макрофага in vivo alveolar phagocytosis подтвердите соответствующий уровень седенции отсутствием реакции на щепотку носа в обезболивающей мыши и поместите мышь на плоскую доску с пластиковой проволокой под верхними резцами. Поместите мышь в полууляхую трибуну в положении 45 градусов с брюшной поверхностью, обращенной вверх, и используйте изогнутые типсы, чтобы вытащить и подавить язык. Затем вставьте микросхему между вокальными складками, чтобы внутритравно ввезти 50 микролитров по пять раз по шесть колонийообразующих единиц P.aeruginosa GFP в легкие обезболивающего животного.
Чтобы подтвердить, что микросхема находится в трахее, аккуратно переместите шприц и наблюдайте за вокальными складками по обе стороны иглы. Через час после заражения, собирать жидкость лаважа, как только что продемонстрировали и гранулы альвеолярных макрофагов центрифугации. Повторное распределение один раз от 10 до третьих клеток в 100 микролитров свежего PBS для цитоцентрифуга на стеклянную горку.
Затем дифференциально окрашивают цитоспун слайды для альвеолярных макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов, согласно стандартным гистохимическим протоколам. Случайным образом выберите 100 альвеолярных макрофагов для количественной оценки процент клеток, которые фагоцитосных бактерий. В первом испытании очистки бактерий in vivo интратрахеально вводят сублеталистную дозу примерно в 2,5-5 раз 10 пятых колонийообразующих единиц на миллилитр P.aeruginosa в анестезируемый дикий тип и мышей-мутантов и измеряют вес тела каждого животного каждый день в течение шести дней.
Во втором испытании, ввести новый набор диких типов и мышей-мутантов со смертельным три раза 10 до семи колоний формирования единиц на миллилитр дозы P.aeruginosa и записывать смертность в течение двух дней после инъекции, собирая всю легочную ткань на момент смерти или через два дня после инъекции для количественной оценки легочной бактериальной нагрузки на пик инфекции. После сбора легких, сократить образцы легких на мелкие кусочки на льду и гомогенизировать фрагменты легких с помощью скорректированной электрической установки гомогенизатора. Затем пластины 100 микролитров гомогената на Pseudomonas изоляции агар пластин в 10-кратной серийных разбавлений.
Флуоресценция микроскопии показывает, что мышь первичного альвеолярного макрофага фагоцитоз латексных бусин FITC происходит после одного часа инкубации, с TRIM72 нокаут макрофагов демонстрирует значительно более высокую фагоцитарную способность. И наоборот, переэкспрессия TRIM72, белка с неизвестной функцией в клетках макрофага мурина, приводит к более чем пятикратное снижение фагоцитоза дополнения. Alexa fluor-488 конъюгированных частиц зимозан-А, однако, попадает в равном количестве первичных альвеолярных макрофагов, изолированных от дикого типа или нокаут мышей.
Дифференциальное окрашивание BALF, собранного из диких животных и нокаутов, показывает аналогичное количество макрофагов, но более высокую фагоцитическую способность макрофагов, собранных у нокаут-мышей. Кроме того, мышей нокаутом TRIM72 продемонстрировать более быстрое восстановление их веса тела, сохранить их выживание, и проявляют более низкое бактериальное бремя, чем дикие животные типа после интратрахальной администрации P.aeruginosa. Используя этот метод, другие фагоцитные процессы, которые важны для пневмонии, такие как нейтрофиловый фагоцитоз и относительный вклад других фагоцитов в очистку бактерий могут быть проанализированы.
В сочетании с фармакологическими ингибиторами, адаптивной передачей и трансгенными животными, этот метод может помочь исследователям исследовать молекулярный компонент конкретного типа фагоцитоза для фагоцитов, представляющих интерес.
