슈도모나스 아에루기노사는 BSL-2 레벨 병원균이다. 이 유기체를 취급할 때 모든 BSL-2 수준의 안전 관행을 따르는 것을 기억하십시오. 여기에서 우리는 1 차세포 격리, 체외 phagocytosis 및 phagocytic 통로 분석, 그리고 생쥐에 있는 생체 교피토증 및 세균성 통관 평가를 보여줄 것입니다.
성공적인 장내 전달에는 마스터하는 연습이 필요합니다. 마이크로스프레이가 제대로 로드되고 바늘이 두 개의 보컬 접기 사이에 있고 플런저 속도가 제대로 제어되는지 확인하십시오. 종이 타월로 덮인 해부 보드에 팔다리가 퍼지는 척추 위치에 마우스를 고정하고 앞니 아래에 끈을 연결하여 기관을 직선과 레벨로 배치할 수 있도록 하십시오.
70%에탄올로 마우스를 소독하고 일반 집게를 사용하여 신체의 중심선에서 피부를 당깁니다. 외과 가위를 사용하여 복부에서 목구멍 의 상단까지 피부를 자른다. 표준 수술 가위의 무딘 끝을 사용하여 목 근육과 결합 조직을 조심스럽게 해부하십시오.
흉곽 아래 복벽을 엽니다. 다이어프램을 자르고 흉곽의 하부부분을 잘라 폐를 부분적으로 노출시합니다. 스프링 가위를 사용하여 기관지를 노출하고 집게를 사용하여 연골 링을 잡습니다.
마이크로 가위를 사용하여 기관지의 복부 면에 약 1.5 밀리미터 절개를 조심스럽게 만듭니다. 기관 아래에 짧은 봉합사 스레드를 조심스럽게 묶고 기관지에 18 게이지 캐뉼라를 삽입합니다. 캐뉼라가 제자리에 있을 때, 세척당 신선한 PBS 1밀리리터로 폐를 세 번 부드럽게 씻어내고, 액체를 주사기로 부드럽게 인출한 후 3회 연속 폐로 되돌려 놓습니다.
각 라베이지 후, 수집된 기관지알베올라 라베이지 유체 또는 BALF를 15밀리리터 원추형 튜브로 이송하여 총 수확된 유체의 원심분리를 한다. 두 번째 원심 분리를 위해 신선한 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세척 된 폐포 대식세포를 덜베코의 수정 된 독수리 매체 또는 DMEM의 2 밀리리터로 10 % 불열 불활성 태아 소 혈청으로 보충합니다. 그런 다음 1 차 폐포 대식세포를 세포 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2 일 간의 문화를 위해 유리 바닥 페트리 접시에 옮습니다.
48 시간 후, 신선한 매체의 두 밀리리터와 문화를 공급하기 전에 PBS의 1 밀리리터로 문화를 씻어. 다음으로, 세포당 50마이크로미터 직경의 카박스형 라텍스 FITC-컨쥬게이트 구슬을 세포 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 배양배기에 첨가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 세포 외 구슬을 제거하고 무작위로 세포 내 구슬을 포함하는 세포를 계산하기 위해 세척 당 신선한 PBS의 1 밀리리터와 함께 플레이트를 광범위하게 5 번 세척.
편협 분석의 경우, 토끼 항 SRBC 면역글로불린 M 또는 IgM의 50 마이크로리터를 실온에서 30분 동안 50마이크로리터로 8번째 양 적혈구 또는 SRBC에 2회 배양한다. 그런 다음 Opsonized SRBC를 C5 결핍 인간 혈청 50 마이크로리터로 30분 동안 섭씨 37도에서 배양하여 IgM 코팅 SRBC의 C3b 및 C3b 억제제 보완 조각을 수정합니다. 다음으로, 매체를 흡권하고 100마이크로리터를 중간 밀리리터당 7개의 공손화된 SRBC에 100마이크로리터를 첨가하여 10배를 함유한 96웰 플레이트의 각 웰에 10~4박 배양된 뮤린 대식파지당.
SRBC 마우스 대식세포 공동배양은 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 다음, 염화칼륨 용해 완충제 100마이크로리터로 세척하여 불바운드 SRBC를 제거합니다. 언바운드 SRBC가 제거된 후 100마이크로리터의 미디어로 헹구는 것입니다. 남은 세포를 0.1%의 도데딜 황산나트륨으로 리세우하고 과산화수소 3%와 6개의 어금니를 보충한 2, 7-이미노플루오렌의 50마이크로리터로 리자츠를 치료한다.
그런 다음 620 나노미터에서 분광계에서 헤모글로빈 촉매 형광청 형성의 흡광도를 측정합니다. 알려진 수의 SRBC를 가진 620 나노미터 흡광도 값의 표준 곡선을 사용하여 phagocytized 되는 불투명한 SRBC의 수를 결정합니다. 패턴 인식 수용체 매개 phagocytosis를 평가하기 위하여는, PBS의 1밀리리터로 2 일 배양마우스 1 차용성 대식세포를 세척하고 100 알렉사 플루올러-488를 포함하는 신선한 매체의 500 마이크로리터로 세포를 취급합니다 Zymosan-A-bioparticles.
섭씨 37도에서 1시간 후, 500마이크로리터의 얼음차가운 PBS로 식세포증을 체포하고 세척당 PBS 1밀리리터로 셀을 5회 광범위하게 세척합니다. 마지막 세척 후, 실온에서 10 분 동안 4 %의 파라 포름 알데히드로 세포를 수정하고 입증 된 대로 세포를 5 번 더 씻으시다. 마지막 세척 후, 488 나노미터에서 차동 간섭 대조 및 형광 채널에서 이미징을 위한 신선한 PBS의 500 마이크로리터로 세포를 커버하여 Zymosan-A-생체입자 함유 폐포 대식세포의 수를 정량화한다.
생체 내 폐포 대식세포 증시 평가의 경우, 마취된 마우스에 발가락 꼬집어 에 대한 반응 부족으로 적절한 수준의 체증을 확인하고 상부 절개 아래에 플라스틱 와이어가 있는 플랫 보드에 마우스를 놓습니다. 마우스를 45도 위치에 반억지로 놓고 복부 표면을 위쪽으로 향하고 곡선 포셉을 사용하여 혀를 꺼내억제합니다. 그런 다음 발성 접기 사이에 마이크로스프레이를 삽입하여 마취된 동물의 폐에 P.aeruginosa GFP의 6개 식민지 형성 유닛에 5회 10번의 50마이크로리터를 내체 투여한다.
마이크로스프레이 바늘이 기관체에 있는지 확인하기 위해 주사기를 부드럽게 움직이고 바늘양쪽의 보컬 주름을 관찰한다. 감염 후 1시간 후, 방금 시연된 대로 용액을 수집하고 원심분리에 의해 폐포 대식세포를 펠릿합니다. 유리 슬라이드에 사이토 센심 분리기를 위한 신선한 PBS의 100 마이크로리터에서 세 번째 세포에 10번 을 다시 중단합니다.
그런 다음 표준 조직화학 프로토콜에 따라 폐포 대식세포, 호중구 및 림프구용 사이토스펀 슬라이드를 분분적으로 얼룩지게 합니다. 무작위로 선택 100 폐포 대식세포는 phagocytos박테리아 세포의 비율을 정량화. 생체 내 세균 통관 시험에서, 내체는 약 2.5~ 5배 10배의 치사 주사용량을 P.aeruginosa의 밀리리터당 5번째 콜로니 형성 단위를 마취 야생 형 및 돌연변이 마우스로 주입하고 6 일 동안 매일 각 동물의 체중을 측정합니다.
두 번째 시험에서는, 치명적인 3회 10을 가진 새로운 야생형 및 돌연변이 마우스를 P.aeruginosa의 밀리리터 투여량당 7개의 콜로니 형성 단위로 주입하고 주사 후 2일 이내에 사망률을 기록하고, 사망 시 또는 이틀 후에 폐 조직 전체를 수집하여 폐 세균성 부담을 피크 감염시 정량화한다. 폐를 수확한 후, 폐 샘플을 얼음의 작은 조각으로 자르고 조정된 전기 균질화 설정을 사용하여 폐 조각을 균질화합니다. 그런 다음 10배 의 연속 희석으로 슈도모나스 절연 한천 판에 호모게네이트 100 마이크로리터를 플레이트합니다.
형광 현미경 검사법은 FITC 라텍스 구슬의 마우스 1 차대 폐포 대식세포가 잠복한 1 시간 후에 발생한다는 것을 밝힙니다. 반대로, 뮤린 대식세포에서 알 수 없는 기능을 가진 단백질인 TRIM72의 과발현은 식세포증을 5배 이상 감소시합니다. 그러나 알렉사 플루오-488은 야생형 또는 녹아웃 마우스로부터 분리된 1차 폐포 대식세포에 의해 동일한 양으로 섭취된다.
야생 유형과 녹아웃 동물에서 수확 한 BALF의 차동 얼룩은 유사한 수의 대식세포이지만 녹아웃 마우스에서 수확 한 대식세포에 대한 더 높은 식세포 능력을 보여줍니다. 또한, TRIM72 녹아웃 마우스는 체중의 빠른 회복을 입증하고, 생존을 유지하고, 내내 막피 투여 후 야생형 동물보다 세균성 부담을 낮춥다. 이 기술을 이용하여, 호중구 식세포증과 같은 폐렴에 중요한 다른 식세포 과정과 박테리아 클리어런스에 있는 그밖 phagocytes의 상대적인 기여는 분석될 수 있습니다.
약리학적 억제제, 적응형 전이 및 형질전환 동물과 함께 이 기술은 연구원이 관심 있는 phagocytosis의 특정 유형의 분자 성분을 탐구하는 데 도움이 될 수 있습니다.
