Pseudomonas aeruginosa é um patógeno de nível BSL-2. Lembre-se de seguir todas as práticas de segurança de nível BSL-2 ao manusear este organismo. Aqui demonstraremos o isolamento celular primário, a fagocitose in vitro e a análise da via fagocítica, e a phagocytose in vivo e a avaliação de liberação bacteriana em camundongos.
A entrega intratraqueal bem sucedida requer prática para dominar. Certifique-se de que a microsprayer está devidamente carregada, a agulha está entre as duas dobras vocais e a velocidade do êmbolo está devidamente controlada. Comece prendendo o rato na posição supina com os membros espalhados em uma placa de dissecção coberta com toalhas de papel e enganchando uma corda sob os dentes da frente para retrair a cabeça para que a traqueia seja posicionada em linha reta e nivelada.
Desinfete o rato com 70% de etanol e use fórceps regulares para puxar a pele na linha central do corpo. Use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele do abdômen até o topo da garganta. Use a extremidade cega da tesoura cirúrgica padrão para dissecar cuidadosamente o músculo da garganta e os tecidos conjuntivos.
Abra a parede abdominal abaixo da caixa torácica. Corte o diafragma e corte a parte inferior da caixa torácica para expor parcialmente os pulmões. Use uma tesoura de mola para expor a traqueia e use os fórceps para agarrar um anel de cartilagem.
Use micro tesoura para fazer cuidadosamente uma incisão de aproximadamente 1,5 milímetros na face ventral da traqueia. Amarre cuidadosamente um curto comprimento de rosca de sutura sob a traqueia e insira uma cânula de 18 bitola na traqueia. Quando a cânula estiver no lugar, banque suavemente o pulmão três vezes com um mililitro de PBS fresco por lavagem, retirando suavemente o fluido para a seringa antes de reinfundi-lo de volta para o pulmão por três vezes seguidas.
Após cada lavagem, transfira o fluido de lavage broncoalveolar coletado ou BALF em um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação do fluido total colhido. Resuspend a pelota em um mililitro de PBS fresco para uma segunda centrifugação e resuspenda os macrófagos alveolares lavados em dois mililitros de Dulbecco's Modified Eagles Medium ou DMEM complementado com soro bovino fetal não inativado 10%. Em seguida, transfira os macrófagos alveolares primários para uma placa de Petri de fundo de vidro para sua cultura de dois dias a 37 graus Celsius em uma incubadora celular.
Depois de 48 horas, lave a cultura com um mililitro de PBS antes de alimentar a cultura com dois mililitros de meio fresco. Em seguida, adicione 50 contas de látex de dois micrômetros de dois metros de diâmetro fitc-conjugadas por célula à cultura para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora celular. No final da incubação, lave a placa extensivamente cinco vezes com um mililitro de PBS fresco por lavagem para remover as contas extracelulares e imagem aleatoriamente 100 células para contar as células contendo contas intracelulares.
Para um ensaio de opssonização, incubar duas vezes 10 a oitavas glóbulos vermelhos de ovelhas ou SRBCs com 50 microliters de coelhinho anti-SRBC imunoglobulina M ou IgM por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, incubar os SRBCs opssonizados com 50 microliters de soro humano deficiente c5 por 30 minutos a 37 graus Celsius para corrigir os fragmentos de complemento do inibidor C3b e C3b nos SRBCs revestidos de IgM. Em seguida, aspire a mídia e adicione 100 microliters de uma vez 10 aos sete SRBCs opsonizados por mililitro de médio a cada poço de uma placa de 96 poços contendo uma vezes 10 para o quarto macrófagos murina cultivados durante a noite por poço.
Incubar a cocultura de macrófago do rato SRBC por uma hora a 37 graus Celsius e, em seguida, remova os SRBCs não vinculados lavando com 100 microliters de tampão de potássio de cloreto de amônio por um minuto. Depois que os SRBCs desvinculados tiverem sido removidos, enxágue com 100 microliters de mídia. Lise as células restantes com sulfato de dodecil de 0,1% de sódio e trate os lysates com 50 microlitadores de 2, 7 diaminofluoreno suplementado com peróxido de hidrogênio de 3% e seis ureia molar.
Em seguida, meça a absorvância da formação azul fluoreno catalisada por hemoglobina em um espectotógrafo a 620 nanômetros. Use uma curva padrão a 620 valores de absorção de nanômetros com número conhecido de SRBCs para determinar o número de SRBCs opsonizados que são fagocitizados. Para avaliar a fagocitose mediada pelo receptor de reconhecimento de padrões, lavevejar macrófagos alveolares primários de dois dias com um mililitro de PBS e trate as células com 500 microlitadores de meio fresco contendo 100 fluor-488 biopartículas zymosan-a conjugadas.
Depois de uma hora a 37 graus Celsius, prenda a faagocytose com 500 microliters de PBS gelado e lave as células extensivamente cinco vezes com um mililitro de PBS por lavagem. Após a última lavagem, fixar as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente e lavar as células mais cinco vezes como demonstrado. Após a última lavagem, cubra as células com 500 microliters de PBS fresco para imagens sob contraste de interferência diferencial e canal fluorescente a 488 nanômetros para quantificar o número de macrófagos alveolares contendo Zymosan-A-biopartículas.
Para avaliação in vivo alveolar de fagocitose de macrófago, confirme o nível adequado de sedação por falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato anestesiado e coloque o mouse em uma tábua plana com um fio de plástico sob os incisivos superiores. Coloque o mouse em um rostrum semi-reclinável em posição de 45 graus com a superfície ventral voltada para cima e use fórceps curvos para puxar para fora e suprimir a língua. Em seguida, insira uma microsprayer entre as dobras vocais para administrar intratracheicamente 50 microliters de cinco vezes 10 para as seis unidades formadoras de colônias de P.aeruginosa GFP nos pulmões do animal anestesiado.
Para confirmar que a agulha de microsprayer está na traqueia, mova suavemente a seringa e observe as dobras vocais em ambos os lados da agulha. Uma hora após a infecção, colete o fluido de lavagem como acabou de demonstrar e pelota os macrófagos alveolares por centrifugação. Resuspend uma vez 10 a terceira células em 100 microliters de PBS fresco para citocentrifuuge em um slide de vidro.
Em seguida, colorir diferencialmente os slides citospun para macrófagos alveolares, neutrófilos e linfócitos, de acordo com os protocolos histoquímicos padrão. Selecione aleatoriamente 100 macrófagos alveolares para quantificar a porcentagem de células que phagocytosed bactérias. No primeiro teste de liberação de bactérias in vivo, intracheally injetar uma dose subletal de aproximadamente 2,5 a cinco vezes 10 unidades formadoras de quinta colônia por mililitro de P.aeruginosa em tipo selvagem anestesiado e camundongos mutantes e medir o peso corporal de cada animal todos os dias durante seis dias.
No segundo ensaio, injete um novo conjunto de camundongos selvagens e mutantes com uma letal três vezes 10 às sete unidades formadoras de colônias por dose mililitro de P.aeruginosa e regisse a mortalidade dentro de dois dias de uma injeção, coletando todo o tecido pulmonar no momento da morte ou dois dias após a injeção para quantificação da carga bacteriana pulmonar no pico da infecção. Após a colheita dos pulmões, corte as amostras pulmonares em pequenos pedaços no gelo e homogeneize os fragmentos pulmonares usando um ajuste de homogeneizador elétrico ajustado. Em seguida, placa 100 microliters de homogeneizar em placas de ágar de isolamento pseudomonas em diluições seriais de 10 vezes.
A microscopia de fluorescência revela que a fagocitose de macrófago alveolar primário do camundongo das contas de látex FITC ocorre após uma hora de incubação, com macrófagos trim72 eliminando uma capacidade fagocítica significativamente maior. Por outro lado, a superexpressão do TRIM72, uma proteína com função desconhecida em células macrófagos de murina, resulta em uma diminuição de mais de cinco vezes na fagocitose complementar. As partículas zymosan-A conjugadas alexa fluor-488 conjugadas, no entanto, são ingeridas em igual quantidade por macrófagos alveolares primários isolados de camundongos selvagens ou eliminados.
A coloração diferencial do BALF colhido de animais selvagens e animais de nocaute revela um número semelhante de macrófagos, mas uma maior capacidade fagocítica para os macrófagos colhidos de camundongos eliminados. Além disso, os camundongos knockout TRIM72 demonstram uma recuperação mais rápida de seus pesos corporais, mantêm sua sobrevivência e exibem uma carga bacteriana menor do que animais do tipo selvagem após a administração intratracheal P.aeruginosa. Utilizando essa técnica, outros processos fagocíticos importantes para pneumonia, como a fagocitose de neutrófilos e a contribuição relativa de outros fagocitos no despejo de bactérias podem ser analisados.
Em combinação com inibidores farmacológicos, transferência adaptativa e animais transgênicos, essa técnica pode ajudar os pesquisadores a explorar o componente molecular do tipo específico de fagocitose para os fagocitos de interesse.
