Нестимуляторные пептидные комплексы MHC не активируют Т-клетки, но могут усилить реакцию Т-клеток на агонистный пептид MHC. Этот протокол описывает экспериментальную систему для исследования коагонизма во время активации Т-клеток ЧЕЛОВЕКА CD8. Мы выражаем молекулы MHC как одноколесные комплексы с ковалентно-связанной тяжелой цепью, бета-2-микроглобулином и пептидом.
Это позволяет вводить мутации в молекулы MHC, представляя предопределенные пептиды. В этом протоколе используется клон CTN человека, специфичный для эпитопа вируса гепатита В. Понимание механизма коагонизма при реакциях Т-клеток против гепатита может способствовать развитию иммунотропов против этой вирусной инфекции.
Представленные методы могут быть использованы в исследованиях и других фундаментальных аспектах активации Т-клеток в Т-клеточных системах человека с известной специфичностью пептида MHC. В этом протоколе используются одноко цепи молекул MHC класса I человека, состоящие из последовательности сигналов, пептида интереса, связующих звенья, человека бета-2-микроглобулина linker, и MHC тяжелой цепи. Пептид E1A3 от гепатита В используется в качестве агонистного пептида.
Gag от ВИЧ используется в качестве нестимуляторного пептида. Однококлеточные молекулы МХК человека выражаются в линии клеток хомяка, содержащей тетрациклин-репрессор. Агонист однокоголовый MHC выражается с использованием тетрациклин-индуцированных плазмид, в результате чего очень низкий уровень экспрессии в отсутствие тетрациклина, и высокий уровень экспрессии в присутствии тетрациклина.
Клетки CHO, выражаюющие низкий уровень агонистного пептида MHC, трансфицированы составно выраженным нестимуляторным пептидом MHC. Использование этой экспериментальной системы позволяет сравнивать реакции Т-клеток с агонистным пептидом MHC при наличии или отсутствии нестимуляторного пептида MHC. Чтобы начать эту процедуру, культивировать CHO клетки в колбе Т-75, как указано в текстовом протоколе.
За день до эксперимента по активации Т-клеток, мыть клетки в колбе с PBS. Добавьте раствор, содержащий 05%трипсина и 2%EDTA в PBS, и инкубировать в течение пяти-десяти минут при комнатной температуре. Используя световой микроскоп, наблюдайте за клетками, чтобы убедиться, что они отделились.
Затем добавьте полный F12 в колбу, чтобы остановить трипсинизацию. Перенесите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку. Центрифуга при 400G в течение пяти минут, и удалить супернатант либо трубопроводов или декантирования.
Повторно приостанавливайте гранулы ячейки в пяти миллилитров полного F12. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток и корректировки концентрации клеток до 200 000 клеток на миллилитр в CF12. Добавьте от 50 до 60 нанограмм на миллилитр тетрациклина в образцы только агониста, чтобы вызвать большое количество агонистного выражения класса PMHC I в качестве положительного контроля.
После этого смешайте клетки CHO либо вихрем, либо пипетки. Добавьте 100 микролитров клеточной подвески к каждому колодец пластины U-bottom 96-well. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.
За день до эксперимента центрифуга CTLS клетки при 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Используйте гемоцитометр, чтобы подсчитать клетки, и повторно приостановить их при плотности одного миллиона клеток на миллилитр в полном человеческих Т-клеток без цитокинов или PHA. Инкубировать CTLs ночь на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.
На следующий день центрифуга Т-клеток в 400 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки в 2 миллилитров полного без сыворотки мультимедиа. Используйте гемоцитометр для подсчета Т-клеток и корректировки их плотности до одного миллиона живых клеток на миллилитр в полных Т-клеточных средствах массовой информации человека.
Добавьте анти-человеческое антитело CD107a при разбавлении от одного до 100, и Brefeldin A при разбавлении от одного до 1000. Затем извлечения 96-хорошо пластины, содержащей клетки CHO. Используя стеклянную пипетку Pasteur, аспирировать средства массовой информации из клеток CHO.
Добавьте к каждой колодец 200 микролитров подвески Т-клеток. Со-культура Т-клеток с клетками CHO при 37 градусах по Цельсию с 5%-углеродным диоксидом в течение трех-четырех часов. В конце совместной культуры, центрифуга 96-хорошо пластины на 400 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.
Удалите супернатант, аспирируя или стряхивая. Затем добавьте 2,5 микролитров антител CD3 и 2,5 микролитров антител CD8 в 50 микролитров 5%BSA в PBS к каждой хорошо, для окрашивания поверхности клеток антигена, и смешать с помощью пипетки. Инкубировать образцы в темноте, и на льду, в течение 30 минут.
После этого добавьте 150 микролитров буфера для мытья к каждому хорошо, чтобы вымыть образцы. Центрифуга образцов в 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Удалите супернатант, аспирируя или стряхивая.
Установите комплект фиксации/пермеабилизации и добавьте 100 микролитров раствора фиксации/пермеабилизации к каждой колодец и пипетку для смешивания. Инкубировать на льду в течение 20 минут. Затем центрифуга пластины на 400 раз G при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и добавьте 200 микролитров буфера 1X perm/wash к каждой хорошо. Повторите этот процесс от центрифугации через добавление буфера завивки/мытья один раз. После этого повторно приостанавливают клетки в 50 микролитров буфера завивки/мытья, содержащего анти-интерферон-гамму с концентрацией 3 микрограмма на миллилитр.
Инкубировать на льду в темноте в течение 30 минут. Далее добавьте 150 микролитров буфера 1X perm/wash. Центрифуга при 400G, четыре градуса по Цельсию, в течение пяти минут.
Удалите супернатант и добавьте 200 микролитров буфера 1X perm/wash. Центрифуга пластины снова в 400 раз G, четыре градуса по Цельсию, в течение пяти минут, и удалить супернатант, аспирируя или стряхивая. Повторно приостанавливайте образец в 200 микролитров буфера для мытья и приступайте к цитометрическому анализу.
За день до эксперимента смешайте клетки ЧО либо вихрем, либо трубой. Затем добавьте один миллилитр клеточной подвески к каждому колодец из 12-хорошо пластины. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.
В день эксперимента используйте клеточный скребок, чтобы отделить клетки CHO от нижней части каждой хорошо. Перенесите один миллилитр средств массовой информации, содержащих клетки из каждой системы, в трубки FACS. Центрифуга при 400 градусах G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Повторно приостановить в 100 микролитров анти-HLA антитела разбавлены в буфере мытья. Инкубировать на льду в течение 30 минут. Затем добавьте один миллилитр буфера стирки в каждый образец CHO.
Центрифуга при 400 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта. Повторно приостанавливайте каждый образец в 3 миллилитров буфера стирки и приступайте к анализу цитометрии потока. В этом исследовании представлен надежный инструмент для исследования молекулярного взаимодействия во время положительной активации Т-клеток человека CD8.
Разработанная ксеногенная система генерируется, которая представляет низкие уровни агонистного pMHC при наличии или отсутствии агонистного pMHC. Эти инженерные БТРы затем используются для стимулирования E183-специфического человека CD8 положительный клон Т-клеток. Нетрансфицированные клетки CHO и CHO-клетки, выражают нестимуляторный одноко цепной комплекс Gag-MHC, не вызывают активации.
Экспрессия высоких уровней агонистного одномагнитного комплекса E183-MHC, который является положительным элементом управления, как считается, вызывает очень эффективное производство интерферона-гамма и дегрануляцию, демонстрируя, что одночегоночная конструкция E183 может быть распознана конкретным TCR для активации функций эффектора Т-клеток. Выражение низких уровней одноко цепью комплекса Е183-МХК вызывает более низкие уровни интерферон-гамма-производства и дегрануляции, что было усилено наличием нестимуляторного комплекса Gag-MHC. Обратите внимание, что очень высокий процент клеток CD107a-T наблюдается даже в ответ на низкие уровни антигенного pMHC, что согласуется с предыдущими исследованиями.
Однако наличие нестимуляторного комплекса Gag-MHC увеличивает CD107a МФО. Во время этой процедуры, очень важно контролировать агонист пептид MHC выражение для обеспечения равной агонистической презентации с или без нестимуляторного пептида. Очень важно количественно агонист пептид MHC выражение с использованием TCR-как антитела в каждом эксперименте.
Альтернативный подход заключается в использовании поддерживаемых липидных билейеров, или бисера, представляя фиксированное количество агонистного пептида MHC в присутствии нестимуляторного пептида MHC. Эти экспериментальные системы должны позволить тестирование нескольких нестимуляторных пептидных последовательностей для коагонизма. Одноклеточная технология MHC может быть использована для исследования молекулярных взаимодействий при активации Т-клеток CD4, а также для исследования неклассических молекул MHC.
Этот протокол использует человеческую кровь и человеческие клетки. Следуйте всем необходимым мерам предосторожности при работе с человеческой кровью, чтобы уменьшить риск передачи заболеваний, передающихся через кровь.
