Les complexes peptidiques non stimulants du MHC n’activent pas les cellules T, mais peuvent améliorer les réponses des cellules T au peptide agoniste MHC. Ce protocole décrit un système expérimental pour étudier le co-agonisme pendant l’activation humaine des lymphocytes T CD8. Nous exprimons des molécules de MHC comme complexes à chaîne unique avec la chaîne lourde covalently-liée, bêta-2-microglobuline, et le peptide.
Cela permet d’introduire des mutations dans les molécules du MHC présentant des peptides prédéterminés. Ce protocole utilise un clone humain de CTN, un spécifique pour un épitope du virus de l’hépatite B. Comprendre le mécanisme du co-agonisme pendant les réponses des cellules T contre l’hépatite peut contribuer au développement d’immunotropiques contre cette infection virale.
Les méthodes présentées peuvent être utilisées dans la recherche et d’autres aspects fondamentaux de l’activation des cellules T dans les systèmes humains de cellules T avec la spécificité connue du peptide MHC. Ce protocole utilise des molécules humaines de classe I du MHC à chaîne unique, composées d’une séquence de signal, d’un peptide d’intérêt, d’un lieneur, d’un lien humain bêta-2-microglobuline et d’une chaîne lourde du MHC. Le peptide E1A3 de l’hépatite B est utilisé comme peptide agoniste.
Le bâillon du VIH est utilisé comme peptide non stimulant. Les molécules humaines de MHC à chaîne unique sont exprimées dans une lignée cellulaire de hamster contenant le répresseur de tétracycline. Le MHC agoniste à chaîne unique est exprimé à l’aide d’un plasmide inductible à la tétracycline, ce qui entraîne des niveaux d’expression très faibles en l’absence de tétracycline et des niveaux d’expression élevés en présence de tétracycline.
Les cellules CHO exprimant de faibles niveaux de MHC peptide agoniste sont transfectées avec le MHC non stimulant constitutif exprimé de peptide. L’utilisation de ce système expérimental permet de comparer les réponses des cellules T au peptide agoniste MHC en présence ou en l’absence de peptide non stimulant MHC. Pour commencer cette procédure, cultiver les cellules CHO dans un flacon T-75, tel que décrit dans le protocole de texte.
La veille de l’expérience d’activation des cellules T, lavez les cellules dans le flacon avec PBS. Ajoutez une solution contenant 05% trypsine et 2%EDTA en PBS, et incubez pendant cinq à dix minutes à température ambiante. À l’aide d’un microscope léger, observez les cellules pour vous assurer qu’elles se sont détachées.
Ajoutez ensuite f12 complet au flacon pour arrêter la trypsinisation. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Centrifugeuse à 400G pendant cinq minutes, et enlever le supernatant par pipetting ou décantation.
Suspendre à nouveau la pastille cellulaire en cinq millilitres de F12 complet. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules, et ajustez la concentration cellulaire à 200 000 cellules par millilitre en CF12. Ajouter 50 à 60 nanogrammes par millilitre de tétracycline aux échantillons agonistes seulement pour induire des quantités élevées d’expression agoniste de classe I du PMHC comme un contrôle positif.
Après cela, mélanger les cellules CHO soit par vortex ou pipetting. Ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond U. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
La veille de l’expérience, centrifugeuse cellules CTLS à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et suspendez-les à une densité d’un million de cellules par millilitre dans les médias complets des lymphocytes T humains sans cytokines ni PHA. Incuber les LT pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.
Le lendemain, centrifugez les cellules T à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez les cellules en 2 millilitres de supports complets sans sérum. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules T et ajustez leur densité à un million de cellules vivantes par millilitre dans les cellules T humaines complètes.
Ajoutez l’anticorps anti-humain CD107a à une dilution d’un à 100, et brefeldin A à une dilution d’un à 1000. Ensuite, récupérez la plaque de 96 puits contenant les cellules CHO. À l’aide d’une pipette pasteur en verre, aspirer le média à partir des cellules CHO.
Ajouter 200 microlitres de la suspension des cellules T à chaque puits. Co-culture des cellules T avec des cellules CHO à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois à quatre heures. À la fin de la co-culture, centrifuger la plaque de 96 puits à 400 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Retirez le surnatant en aspirant ou en feuilletant. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres d’anticorps CD3 et 2,5 microlitres d’anticorps CD8 dans 50 microlitres de 5%BSA dans PBS à chaque puits, pour la coloration de l’antigène de surface cellulaire, et mélanger par pipetting. Incuber les échantillons dans l’obscurité, et sur la glace, pendant 30 minutes.
Après cela, ajouter 150 microlitres de tampon de lavage à chaque puits pour laver les échantillons. Centrifuger les échantillons à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnatant en aspirant ou en feuilletant.
Établissez un kit de fixation/permeabilisation et ajoutez 100 microlitres de solution de fixation/permeabilisation à chaque puits, et pipette à mélanger. Incuber sur la glace pendant 20 minutes. Ensuite, centrifugez la plaque à 400 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Jetez le supernatant et ajoutez 200 microlitres de tampon de 1X perm/wash à chaque puits. Répétez ce processus à partir de centrifugation en ajoutant le tampon perm/wash une fois. Après cela, re-suspendre les cellules dans 50 microlitres de perm / tampon de lavage contenant anti-interféron-gamma à une concentration de 3 microgrammes par millilitre.
Incuber sur la glace dans le noir pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon de 1X perm/wash. Centrifugeuse à 400G, quatre degrés Celsius, pendant cinq minutes.
Retirer le supernatant et ajouter 200 microlitres de tampon 1X perm/wash. Centrifugez la plaque à nouveau à 400 fois G, quatre degrés Celsius, pendant cinq minutes, et retirez le supernatant en aspirant ou en feuilletant. Suspendre à nouveau l’échantillon dans 200 microlitres de tampon de lavage et procéder à l’analyse cytométrique.
Un jour avant l’expérience, mélanger les cellules CHO soit par vortex ou pipetting. Ajouter ensuite un millilitre de suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 12 puits. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Le jour de l’expérience, utilisez un grattoir cellulaire pour détacher les cellules CHO du fond de chaque puits. Transférez le millilitre de supports contenant les cellules de chaque puits aux tubes FACS. Centrifugeuse à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Re-suspendre en 100 microlitres d’anticorps anti-HLA dilués dans le tampon de lavage. Incuber sur la glace pendant 30 minutes. Ajouter ensuite un millilitre de tampon de lavage à chaque échantillon CHO.
Centrifugeuse à 400 fois G et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Suspendez à nouveau chaque échantillon en 3 millilitres de tampon de lavage et procédez à l’analyse de cytométrie d’écoulement. Dans cette étude, un outil robuste est présenté pour l’étude de l’interaction moléculaire pendant l’activation positive humaine de cellule T de CD8.
Un système xénogénique conçu est généré qui présente de faibles niveaux de pMHC agoniste en présence ou en l’absence de pMHC co agoniste. Ces APC conçus sont ensuite utilisés pour stimuler un clone de cellule T positif CD8 humain spécifique à l’E183. Les cellules CHO non infectées et les cellules CHO qui expriment le complexe non stimulant gag-MHC à chaîne unique n’induisent pas d’activation.
L’expression de niveaux élevés du complexe agoniste à chaîne unique E183-MHC, qui est le contrôle positif, est considérée comme induisant une production interféron-gamma très efficace, et la désgranulation, démontrant que la construction e183 à chaîne unique peut être reconnue par un TCR spécifique pour activer les fonctions effectrices des cellules T. L’expression de faibles niveaux de complexe E183-MHC à chaîne unique induit des niveaux inférieurs de production et de dégranulation interféron-gamma, ce qui a été renforcé par la présence d’un complexe non stimulant Gag-MHC. Notez que des pourcentages très élevés de cellules CD107a+T sont observés même en réponse à de faibles niveaux de pMHC antigénique, ce qui est conforme aux études précédentes.
Toutefois, la présence d’un complexe Gag-MHC non stimulant augmente l’IMF CD107a. Au cours de cette procédure, il est essentiel de contrôler l’expression peptidique agoniste du MHC afin d’assurer une présentation agoniste égale avec ou sans peptide non stimulant. Il est essentiel de quantifier l’expression du peptide agoniste du MHC à l’aide d’anticorps de genre TCR dans chaque expérience.
Une autre approche consiste à utiliser des bicouches lipidiques soutenues, ou perles, présentant une quantité fixe de MHC peptide agoniste en présence de MHC peptidique non stimulant. Ces systèmes expérimentaux devraient permettre de tester de multiples séquences de peptides non stimulants pour le co-agonisme. La technologie MHC à chaîne unique peut être utilisée pour étudier les interactions moléculaires dans l’activation des lymphocytes T CD4, ainsi que pour étudier les molécules non classiques du MHC.
Ce protocole utilise du sang humain et des cellules humaines. Suivez toutes les précautions nécessaires lorsque vous travaillez avec du sang humain pour réduire le risque de transmission de maladies transmissibles par le sang.
