Los complejos de MHC de péptido no estimulador no activan las células T, pero pueden mejorar las respuestas de los células T al péptido agonista MHC. Este protocolo describe un sistema experimental para investigar el co-agonismo durante la activación de células T CD8 humanas. Expresamos moléculas MHC como complejos de cadena única con cadena pesada covalentemente ligada, beta-2-microglobulina y el péptido.
Esto permite introducir mutaciones en moléculas MHC que presentan péptidos predeterminados. Este protocolo utiliza un clon humano de CTN, un específico para un epítopo del virus de la hepatitis B. Comprender el mecanismo de co-agonismo durante las respuestas de los células T contra la hepatitis puede contribuir al desarrollo de inmunotrópicos contra esta infección viral.
Los métodos presentados se pueden utilizar en la investigación y otros aspectos fundamentales de la activación de células T en sistemas de células T humanas con especificidad conocida de péptido MHC. Este protocolo utiliza moléculas MHC clase I humanas de cadena única, que consisten en secuencia de señal, péptido de interés, eslabador, eslabador de microglobulina beta-2 humano y cadena pesada MHC. El péptido E1A3 de la hepatitis B se utiliza como péptido agonista.
Gag del VIH se utiliza como péptido no estimulado. Las moléculas de MHC humano de cadena única se expresan en una línea celular de hámster que contiene represor de tetraciclina. El MHC agonista de cadena única se expresa utilizando plásmido inducible por tetraciclina, lo que resulta en niveles de expresión muy bajos en ausencia de tetraciclina, y altos niveles de expresión en presencia de tetraciclina.
Las células CHO que expresan niveles bajos de péptido agonista MHC son trans infectadas con MHC péptido no estimulante expresado constitutivamente. El uso de este sistema experimental permite comparar las respuestas de los células T con el péptido agonista MHC en presencia o ausencia de péptido no estimulado MHC. Para comenzar este procedimiento, cultive las células CHO en un matraz T-75, como se describe en el protocolo de texto.
El día antes del experimento de activación de la célula T, lave las células en el matraz con PBS. Añadir una solución que contenga 05%trypsin y 2%EDTA en PBS, e incubar durante cinco a diez minutos a temperatura ambiente. Usando un microscopio de luz, observe las células para asegurarse de que se han desprendido.
A continuación, agregue F12 completo al matraz para detener la tripsinación. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 400G durante cinco minutos, y retire el sobrenadante ya sea pipeteando o decantando.
Vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de F12 completo. Utilice un hemocitociómetro para contar las células y ajuste la concentración celular a 200.000 células por mililitro en CF12. Añadir de 50 a 60 nanogramos por mililitro de tetraciclina a las muestras sólo agonistas para inducir altas cantidades de expresión agonista pMHC clase I como un control positivo.
Después de esto, mezcle las células CHO ya sea por vórtice o pipeteando. Agregue 100 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de 96 pozos de fondo en U. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
El día antes del experimento, centrifugar las células CTLS a 400 veces G y a cuatro grados celsius durante cinco minutos. Utilice un hemocitociómetro para contar las células y vuelva a suspenderlas a una densidad de un millón de células por mililitro en medios de células T humanas completos sin citoquinas ni PHA. Incubar los CTL durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, centrifugar las células T a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mililitros de medios completos libres de suero. Utilice un hemocitociómetro para contar las células T y ajuste su densidad a un millón de células vivas por mililitro en medios completos de células T humanas.
Agregue el anticuerpo anti-humano CD107a en una dilución de uno a 100, y Brefeldin A en una dilución de uno a 1000. A continuación, recupere la placa de 96 pozos que contiene las células CHO. Usando una pipeta Pasteur de vidrio, aspirar los medios de las células CHO.
Añadir 200 microlitros de la suspensión de la célula T a cada pozo. Co-cultivo de las células T con células CHO a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante tres a cuatro horas. Al final de la co-cultura, centrifugar la placa de 96 pozos a 400 veces G y cuatro grados celsius durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante aspirando o parpadeando. A continuación, agregue 2,5 microlitros de anticuerpos CD3 y 2,5 microlitros de anticuerpos CD8 en 50 microlitros de 5%BSA en PBS a cada pozo, para la tinción de antígenos de superficie celular y mezcle en pipeteando. Incubar las muestras en la oscuridad, y en hielo, durante 30 minutos.
Después de esto, agregue 150 microlitros de tampón de lavado a cada pozo para lavar las muestras. Centrifugar las muestras a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante aspirando o parpadeando.
Establezca un kit de fijación/permeabilización y agregue 100 microlitros de solución de fijación/permeabilización a cada pozo y pipeta para mezclar. Incubar sobre hielo durante 20 minutos. Luego, centrifuga la placa a 400 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros de 1X perm/tampón de lavado a cada pozo. Repita este proceso desde centrifugación a través de la adición del tampón de perm/lavado una vez. Después de esto, vuelva a suspender las células en 50 microlitros de perm/tampón de lavado que contienen anti-interferón-gamma a una concentración de 3 microgramos por mililitro.
Incubar sobre hielo en la oscuridad durante 30 minutos. A continuación, agregue 150 microlitros de 1X perm/tampón de lavado. Centrífuga a 400G, cuatro grados centígrados, durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y agregue 200 microlitros de 1X perm/tampón de lavado. Centrifugar la placa de nuevo a 400 veces G, cuatro grados Centígrados, durante cinco minutos, y retire el sobrenadante aspirando o parpadeando. Vuelva a suspender la muestra en 200 microlitros de tampón de lavado y proceda con el análisis citométrico.
Un día antes del experimento, mezcle las células CHO ya sea por vórtices o pipeteando. A continuación, agregue un mililitro de la suspensión celular a cada pozo de una placa de 12 pozos. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
El día del experimento, utilice un rascador de células para separar las células CHO de la parte inferior de cada pozo. Transfiera el mililitro de medios que contienen las células de cada pozo a los tubos FACS. Centrifugar a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Re-suspender en 100 microlitros de anticuerpos anti-HLA diluidos en tampón de lavado. Incubar sobre hielo durante 30 minutos. A continuación, agregue un mililitro de tampón de lavado a cada muestra cho.
Centrifugar a 400 veces G y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender cada muestra en 3 mililitros de tampón de lavado y proceda al análisis de citometría de flujo. En este estudio, se presenta una herramienta robusta para la investigación de la interacción molecular durante la activación de células T positivas CD8 humanas.
Se genera un sistema xenogénico de ingeniería que presenta bajos niveles de pMHC agonista en presencia o ausencia de pMHC co-agonista. Estos APC diseñados se utilizan entonces para estimular un clon de células T positivas CD8 específicos de E183. Las células CHO no tractificados y las células CHO que expresan el complejo Gag-MHC de cadena única no estimulador no inducen la activación.
La expresión de altos niveles del complejo agonista de una sola cadena E183-MHC, que es el control positivo, se ve para inducir una producción de interferón-gamma muy eficiente, y la degranulación, demostrando que la construcción de una sola cadena E183 puede ser reconocida por un TCR específico para activar las funciones de efector de células T. La expresión de niveles bajos de complejo E183-MHC de cadena única induce niveles más bajos de producción y desgranulación de interferón-gamma, que se mejoró por la presencia de un complejo Gag-MHC no estimulatorio. Tenga en cuenta que se observan porcentajes muy altos de células CD107a+T incluso en respuesta a bajos niveles de pMHC antigénico, lo que es consistente con estudios anteriores.
Sin embargo, la presencia del complejo Gag-MHC no estimulado aumenta la IMF CD107a. Durante este procedimiento, es fundamental controlar la expresión de péptido agonista MHC para asegurar la misma presentación agonista con o sin péptido no estimulatorio. Es fundamental cuantificar la expresión de péptido agonista MHC utilizando anticuerpos similares a TCR en cada experimento.
Un enfoque alternativo es utilizar bicapas de lípidos compatibles, o cuentas, presentando una cantidad fija de péptido agonista MHC en presencia de péptido no estimulado MHC. Esos sistemas experimentales deben permitir la prueba de múltiples secuencias de péptidos no estimuladores para el co-agonismo. La tecnología MHC de cadena única se puede utilizar para investigar interacciones moleculares en la activación de células T CD4, así como para investigar moléculas de MHC no clásicas.
Este protocolo utiliza sangre humana y células humanas. Siga todas las precauciones necesarias al trabajar con sangre humana para reducir el riesgo de transmisión de enfermedades transmitidas por la sangre.
