Os complexos de PEPTÍDEOs não otimistas NÃO ativam células T, mas podem melhorar as respostas das células T ao peptídeo agonista MHC. Este protocolo descreve um sistema experimental para investigar o co-agonismo durante a ativação de células CD8 T humanas. Expressamos moléculas de MHC como complexos uni-acorrentados com cadeia pesada covalente, beta-2-microglobulina, e peptídeo.
Isso permite introduzir mutações em moléculas de MHC apresentando peptídeos predeterminados. Este protocolo usa clone ctn humano, um específico para um epítope de vírus da hepatite B. Compreender o mecanismo do co-agonismo durante as respostas das células T contra a hepatite pode contribuir para o desenvolvimento de imunotrópicos contra essa infecção viral.
Os métodos apresentados podem ser utilizados em pesquisas e outros aspectos fundamentais da ativação de células T em sistemas de células T humanas com especificidade conhecida do PEPtídeo MHC. Este protocolo usa moléculas de MHC humanos de cadeia única, consistindo de sequência de sinal, peptídeo de interesse, linker, linker beta-2-microglobulina humana e cadeia pesada MHC. Peptídeo E1A3 da hepatite B é usado como peptídeo agonista.
A mordaça do HIV é usada como peptídeo não estimulante. As moléculas de MHC humanos de cadeia única são expressas em uma linha celular de hamster contendo repressor de tetraciclina. O MHC de cadeia única agonista é expresso usando plasmídeo indutível de tetraciclina, resultando em níveis de expressão muito baixos na ausência de tetraciclina, e altos níveis de expressão na presença de tetraciclina.
As células CHO expressas baixos níveis de peptídeo agonista MHC são transfeinadas com peptídeo não estimulante expresso constitutivamente. O uso deste sistema experimental permite comparar as respostas das células T ao peptídeo agonista MHC na presença ou ausência de peptídeo não estimulante MHC. Para iniciar este procedimento, cultive células CHO em um frasco T-75, conforme descrito no protocolo de texto.
No dia anterior ao experimento de ativação da célula T, lave as células no frasco com PBS. Adicione uma solução contendo 05% de trippsina e 2% EDTA em PBS, e incubar por cinco a dez minutos à temperatura ambiente. Usando um microscópio leve, observe as células para ter certeza de que elas se separaram.
Em seguida, adicione F12 completo ao frasco para parar a trippsinização. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 400G por cinco minutos e remover o supernatante por pipetação ou decantação.
Suspenda a cápsula de celular em cinco mililitros de F12 completos. Use um hemótmetro para contar as células e ajustar a concentração celular para 200.000 células por mililitro em CF12. Adicione 50 a 60 nanogramas por mililitro de tetraciclina às amostras apenas agonistas para induzir altas quantidades de expressão agonista da classe I pMHC como um controle positivo.
Depois disso, misture as células CHO por vórtice ou pipetação. Adicione 100 microliters da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Um dia antes do experimento, centrífugas ctls células a 400 vezes G e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Use um hemótmetro para contar as células, e suspendê-las a uma densidade de um milhão de células por mililitro em mídia completa de células T humanas sem citocinas ou PHA. Incubar os CTLs durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, centrifugar as células T a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce e suspenda as células em 2 mililitros de mídia completa sem soro. Use um hemótmetro para contar as células T, e ajustar sua densidade para um milhão de células vivas por mililitro em mídia completa de células T humanas.
Adicione anticorpo CD107a anti-humano em uma diluição de 1 a 100, e Brefeldin A em uma diluição de 1 a 1000. Em seguida, recupere a placa de 96 poços contendo as células CHO. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, aspire a mídia das células CHO.
Adicione 200 microliters da suspensão da célula T a cada poço. Co-cultura as células T com células CHO a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três a quatro horas. No final da co-cultura, centrifugar a placa de 96 poços a 400 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos.
Remova o supernatante aspirando ou piscando. Em seguida, adicione 2,5 microliters de anticorpos CD3 e 2,5 microliters de anticorpos CD8 em 50 microliters de 5%BSA em PBS para cada poço, para coloração de antígeno da superfície celular, e misture por pipetação. Incubar as amostras no escuro, e no gelo, por 30 minutos.
Depois disso, adicione 150 microliters de tampão de lavagem a cada poço para lavar as amostras. Centrifugar as amostras a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Remova o supernatante aspirando ou piscando.
Defina um kit de fixação/permeabilização e adicione 100 microliters de solução de fixação/permeabilização a cada poço e pipeta para misturar. Incubar no gelo por 20 minutos. Em seguida, centrifugar a placa a 400 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Descarte o supernatante e adicione 200 microliters de 1X perm/tampão de lavagem a cada poço. Repita este processo a partir da centrifugação através da adição do amortecedor perm/lavagem uma vez. Depois disso, suspenda as células em 50 microliters de perm/wash buffer contendo anti-interferon-gama a uma concentração de 3 microgramas por mililitro.
Incubar no gelo no escuro por 30 minutos. Em seguida, adicione 150 microliters de 1X perm/wash buffer. Centrífuga a 400G, 4 graus Celsius, por cinco minutos.
Remova o supernatante e adicione 200 microliters de 1X perm/wash buffer. Centrifugar a placa novamente a 400 vezes G, quatro graus Celsius, por cinco minutos, e remover o supernatante aspirando ou piscando. Suspenda a amostra em 200 microliters de tampão de lavagem e proceda com análise citométrica.
Um dia antes do experimento, misture as células CHO por vórtice ou pipetação. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão celular a cada poço de uma placa de 12 poços. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
No dia do experimento, use um raspador de células para separar as células CHO do fundo de cada poço. Transfira o mililitro de mídia contendo as células de cada poço para tubos FACS. Centrifugar a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por cinco minutos.
Suspenda-se em 100 microliters de anticorpo anti-HLA diluído no tampão de lavagem. Incubar no gelo por 30 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem a cada amostra de CHO.
Centrifugar a 400 vezes G e a quatro graus Celsius por cinco minutos, e descartar o supernante. Suspenda-se cada amostra em 3 mililitros de tampão de lavagem e prossiga para a análise da citometria de fluxo. Neste estudo, é apresentada uma ferramenta robusta para a investigação da interação molecular durante a ativação de células T positivas CD8 humanas.
Um sistema xenogênico projetado é gerado que apresenta baixos níveis de pMHC agonista na presença ou ausência de pMHC co-agonista. Esses APCs projetados são então usados para estimular um clone de célula T t humano específico de E183. Células CHO não transtraídos e células CHO que expressam o complexo gag-MHC de cadeia única não otimista não induzem ativação.
A expressão de altos níveis do complexo Agonista E183-MHC de cadeia única, que é o controle positivo, é vista para induzir uma produção interferon-gama muito eficiente, e degranulação, demonstrando que a construção E183 de cadeia única pode ser reconhecida por um TCR específico para ativar funções de efeito celular T. A expressão de baixos níveis de complexo E183-MHC de cadeia única induz níveis mais baixos de produção e degranulação interferon-gama, que foi reforçada pela presença de um complexo gag-MHC não otimista. Observe que percentuais muito altos de células CD107a+T são observados mesmo em resposta a baixos níveis de pMHC antigênico, o que é consistente com estudos anteriores.
No entanto, a presença de complexo gag-MHC não otimista aumenta o CD107a MFI. Durante este procedimento, é fundamental controlar a expressão do peptídeo agonista MHC para garantir uma apresentação agonista igual com ou sem peptídeo não estimulante. É fundamental quantificar a expressão de peptídeo agonista MHC usando anticorpos semelhantes a TCR em cada experimento.
Uma abordagem alternativa é usar bicamadas lipídicas suportadas, ou contas, apresentando quantidade fixa de peptídeo agonista MHC na presença de peptídeo não estimulante MHC. Esses sistemas experimentais devem permitir testes de múltiplas sequências de peptídeos não otimistas para co-agonismo. A tecnologia MHC de cadeia única pode ser usada para investigar interações moleculares na ativação de células CD4 T, bem como para investigar moléculas não clássicas de MHC.
Este protocolo usa sangue humano e células humanas. Siga todas as precauções necessárias ao trabalhar com sangue humano para reduzir o risco de transmissão de doenças transmitidas pelo sangue.
