Мы разработали процедуру изоляции клеток трахеальной щетки, редких специализированных химиосенсорных эпителиальных клеток от холина ацетилтрансферазы флуоресцентных мышей-репортеров. Этот метод основан на первоначальном отделении трахеального эпителия от субмукосы, что позволяет последующее более короткое инкубацию эпителиального листа с папаином. Это позволяет надежное восстановление клеток трахеи кисти и был успешно использован для изоляции и транскрипционный анализ клеток кисти с помощью РНК секвенирования.
Длинная инкубация пищеварительными ферментами может снизить жизнеспособность клеток и изменить транскрипционный профиль клеток, изолированных от тканей. Здесь мы отделяем трахеальный эпителий с диспазой и впоследствии инкубируем его папаином в течение короткого периода времени, производя высокие урожаи жизнеспособных клеток кисти. Наш метод может способствовать изучению эпителия верхних дыхательных путей.
Тот же протокол может быть применен к изоляции клеток кисти от других слизистых участков, таких как носовые ткани. Демонстрация нашей воспроизводимой техники позволит ученым-сверстникам изолировать и исследовать клетки трахеи кисти. Чтобы начать эту процедуру, добавьте dispase и DNase I к PBS в окончательных концентрациях, показанных здесь, чтобы подготовить раствор пищеварения dispase.
Убедитесь, что порошок диспаса полностью растворяется перед разогревом раствора в водяной бане при 37 градусах Цельсия. Затем добавьте 5%-тепловой инактивированный FBS в DMEM, чтобы подготовить решение для остановки. Чтобы подготовить буфер Tyrode I, добавьте папаин и L-цистеин в буфер HEPES Tyrode без кальция.
Чтобы подготовить буфер Tyrode II, добавьте лейпептин в буфер HEPES Tyrode без кальция при концентрации двух микролитров на миллилитр. Для подготовки буфера FACS используйте сбалансированный солевой раствор Хэнка без кальция, магния и фенола красного цвета, дополненного двумя миллимоляными ЭДТА и 2%FBS. После усыплять мышь, используйте 21 колею иглы, чтобы исправить его на хирургической доске в положении на спине с расширенными верхними и нижними конечностями.
Спрей меха с 70% этанола для дезинфекции области. Используя прямые типсы, поднимите кожу и мех живота и используйте рассеченные ножницы, чтобы сделать разрез в центре. Используя ножницы, отделяйте кожу от подкожной ткани от живота до кандибулы.
Удерживая подкожные ткани с типсами, сделайте небольшой разрез ножницами в центре брюшной стенки. Затем откройте брюшной полости с V-образным разрезом. Используя миппы, аккуратно переместите тонкий кишечник в сторону.
Найдите брюшную аорту и каву вены и сделайте разрез с рассечением ножниц, чтобы обеспечить быстрое exsanguination. Найдите диафрагму. Используя 18 калибровочных игл, сделать отверстие в диафрагме чуть ниже грудины, чтобы сдуть легкие.
Используя острые заостренные прямые рассеченные ножницы, разрезайте вдоль основания ребер, чтобы тщательно отделить диафрагму от грудной клетки. Используйте типсы, чтобы поднять открытый конец грудины и вырезать грудину продольно от основания грудной клетки к шее. Используйте короткие прямые ножницы, чтобы сделать центральный разрез шейки матки и отделить две доли подмандибулярной железы.
После этого используйте пару высокоточных типсов тонкой точки, чтобы тщательно удалить окружающие соединительной ткани и тимуса чрезмерно карины. Рассекаете трахею свободной, сначала отделяя проксимальный конец на уровне эпиглотти, а затем рассекая дистальный конец на уровне бифуркации трахеи. Найдите эпиглотти и вырежьте трахею продольно от эпиглотти до карины.
Для начала поместите трахею в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую 750 микролитров раствора пищеварения диспаза, предварительно разогретую до 37 градусов по Цельсию. Накройте трубку алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить воздействие прямого света и инкубировать на шейкере при 200 об/мин и при комнатной температуре в течение 40 минут. Затем добавьте 750 микролитров DMEM с 5%FBS, чтобы остановить реакцию и поместить трубку на лед.
Перенесите трахею в чашку Петри. Ориентация трахеи с эпителиальной стороны вверх. Продольно вскрытая трахея имеет полуцевиндрическую форму, поддерживаемую плотоядными кольцами.
Эпителий находится на вогнутой поверхности. Используя прямые типсы, привязать эпиглоттис области трахеи к чашке Петри и использовать размер 22 удаления скальпеля, чтобы соскребать эпителий с трахеи. Эпителиальный слой будет отделяться как полупрозрачный лист.
Используйте скальпель, чтобы измельчить эпителий и перенести эпителиальный слой в двухмиллилитровую трубку. Промыть чашку Петри с 750 микролитров буфера Tyrode I и передать это в трубку, содержащую эпителиальный слой. Обложка трубки с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить воздействие прямого света и инкубировать при 37 градусов по Цельсию на шейкере при 200 об/мин в течение 30 минут.
Затем добавьте 750 микролитров холодного буфера Tyrode II. Вихрь переваренной ткани энергично в течение 20 до 30 секунд. Используя шприц, прикрепленный к игле 18 калибра, тритурировать гомогенат 10 раз.
После этого переключитесь на 21 калибровочных игл и тритурат еще 10-20 раз. Фильтр клетки через 100 микрометровый ситечко в 50 миллилитров конической трубки. Добавьте холодный буфер FACS при соотношении объема 30 к одному.
Центрифуга при 350 градусах г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно посовекуйте гранулы в холодный буфер FACS. Перенесите эту подвеску в полистироловую трубку диаметром 12 на 75 миллиметров.
Центрифуга снова в 350 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы в 100 микролитров буфера FACS. Затем добавьте один микролитер антимошашки CD1632, блокирующий антитела, чтобы блокировать неспецифические связывания и инкубировать на льду в течение 15 минут.
Затем добавьте антитела в соответствующие элементы управления изотипами, изложенные в текстовом протоколе. Инкубировать на льду в течение 45 минут, будучи защищенным от прямого света. После этого добавьте 4,5 миллилитров холодного буфера FACS и перемешайте.
Центрифуга при 350 раз г и при четырех градусах по Цельсию. Отбросьте супернатант и повторно посовелите гранулы в 300 микролитров холодного буфера FACS. Добавьте йодидный пропидий непосредственно перед цитометрической сортировкой потока.
В этом исследовании, трахеи кисти клетки из ChAT eGFP ацетилхолин флуоресцентные мыши репортер успешно изолированы для РНК секвенирования. Клетки идентифицируются из мусора под углом перемотка вперед и сбоку. Дублеты исключаются с помощью форвардной высоты и ширины рассеяния и бокового рассеяния высоты и ширины.
Дублеты являются ячейками, которые имеют высокие значения ширины. В пределах одиночных клеток, живые клетки определены как населенность которая йодидный йодид пропидий отрицательный. В живых одиночных клетках CD45 с низким до отрицательного идентифицируются на основе контроля изотипа.
В CD45 с низким отрицательными клетками, EpCAM положительные клетки, которые также eGFP положительные в канале FITC являются популяция клеток кисти. Номера клеток кисти изменяются в результате воздействия микробных метаболитов и простейших и, следовательно, отражают изменчивость институциональной микробиоты. Поэтому мы предлагаем оценить количество клеток кисти с помощью микроскопии флуоресценции, чтобы оценить ожидаемое количество изолированных клеток кисти путем цитометрической сортировки потока.
Убедитесь в том, чтобы правильно отделить эпителиальный слой трахеи, как он определяет урожайность изолированных клеток кисти. Изолированные клетки трахеи кисти могут быть использованы в широком спектре анализов, таких как секвенирование РНК, культура клеток и функциональный анализ.
