흑색종은 전 세계적으로 널리 진단되며, 발병률이 증가합니다. 이 프로토콜은 흑색종 개시의 초기 단계가 신중하게 통제될 수 있게 해주며, 그 발달의 연구를 용이하게 합니다. 흑색세포 줄기 세포 활성화의 시간과 위치를 제어함으로써, 우리는 줄기 세포 인구 내의 변화와 새로운 균주 흑색종 개시 내의 변화를 분별할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 실험실대학원생인 김다히름과 윤예안이 될 것이다. 시술을 시작하기 2~3일 전에 전기 트리머를 사용하여 7주 된 각 마취된 마우스에서 등갈 피부를 면도합니다. 실험 당일면 면봉을 사용하여 노출된 피부에 얇은 탈모 크림층을 적용합니다.
크림을 고르게 바르면 깨끗한 면봉을 사용하여 크림을 제거하고 젖은 천으로 부드럽게 닦아 잔류 크림을 제거하십시오. 그런 다음 전체 복구될 때까지 모니터링하여 각 마우스를 홈 케이지로 반환합니다. UV-B 조사의 경우, 원하는 부위만 노출되도록 UV-B 보호 재료로 등대 피부를 덮고 UV 내성 뚜껑으로 UV 챔버를 덮습니다.
그런 다음 UV-B 램프를 켜서 마우스를 적절한 실험 기간 동안 조사한 후 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 빈 케이지로 되돌린다. 피부 샘플을 격리하려면 전기 트리머를 사용하여 안락사 된 쥐의 등대 피부 영역에서 머리카락을 제거하고 노출된 피부를 보풀이없는 조직으로 가볍게 브러시하여 영역을 지웁웁습니다. 꼬리 의 바닥 바로 위에 날카로운 가위로 작은 절개를하고 피하 결합 조직을 분리하기 위해 절개에 크고 무딘 가위를 삽입합니다.
날카로운 가위를 사용하여, 신중하게 조직 샘플을 격리하고 깨끗한 종이 타월에 절제 된 피부 조직을 배치하기 위해 관심의 피부 영역의 가장자리를 따라 잘라. 그런 다음 칙칙한 집게를 사용하여 피부를 스트레칭하여 수건을 부착하고 팽팽하게 합니다. 모든 샘플을 수확하면, 피부 샘플과 종이 타월을 주름에 바로 인접한 접힌 필터 용지에 넣고 시료가 매끄럽고 접히거나 구겨지지 않도록 주의하십시오.
필터 용지의 측면을 스테이플로 닫고 용지를 다듬습니다. 그런 다음 실온에서 3~5시간 동안 10% 중성 버퍼링 포머닌에 샘플을 완전히 담그고, 5분간 의 세척을 사용하여 티슈를 탈온화된 물에 세척합니다. 두 번째 세척 후, 피부 조직에서 잔류 재료를 조심스럽게 제거하고 샘플의 가장자리를 다듬어 들쭉날쭉하지 않도록 합니다.
다음으로 각 샘플에서 3개의 적발 절단을 만들어 스트립의 너비가 5밀리미터 를 넘지 않도록 하고, 샘플이 폭이 20밀리미터 이하가 되도록 횡방향 컷을 만듭니다. 최적의 절삭 온도 또는 OCT 매체를 포함하는 저온 몰드를 세로 방향으로 배치하고 10월 위에 4~5개의 스킨을 배치합니다. 모든 조각이 제자리에 있을 때, 두 쌍의 미세 한 집게를 사용하여 각 피부의 긴 가장자리를 극저온 금형의 바닥에 가져와 서 샘플이 10 월 내에 수직이고 곰팡이의 베이스에 수직이되도록하십시오.
그런 다음 금형을 두 번째 입술에 추가 10월로 채우고 금형을 드라이 아이스 조각의 평평한 표면에 놓고, 집게를 사용하여 블록이 필요에 따라 동결되기 시작하면 이송 중에 이동했을 수 있는 모든 피부 조각을 조정합니다. 생쥐가 산후 7주일 때, 그들의 등갈 피부는 텔로겐에 있습니다. 텔로겐 동안, 모낭과 멜라닌 세포줄기 세포는 정지 휴식 상태에 있는 것으로 알려져 있고, 피부는 면도 후에 중요한 머리 성장을 보여주지 말아야 합니다.
화학 적 분 멸, 그러나, 모낭 줄기 세포 활성화를 유도할 수 있습니다., 관심의 영역 내에서 상당한 머리 성장을 유도. 화학적 탈취가 모낭과 멜라닌세포 줄기세포의 활성화를 유의로 유도할 수 있으므로, 활성 상태에서 흑색종경향이 있는 흑색세포 줄기세포는 종양을 형성할 수 있고 미세한 흑색종 개시는 화학적 탈약2주 이내에 관찰될 수 있다. UV-B 조사는 또한 정지, 종양 경향이 멜라닌세포 줄기 세포에서 종양 개시를 유도할 수 있습니다.
중요한 것은, UV-B는 여포 간 피피로 그들의 여포 줄기 세포 틈새에서 멜라노시스 줄기 세포의 직접적인 전좌를 유도합니다. 더욱이, UV-B는 피부 피연전 전반에 걸쳐 흑색세포 줄기 세포 유래 피부흑색종 형성을 유도할 수 있다. 등쪽 피부와 유사하게, UV-B 유도흑색종 개시는 귀 피부와 같은 그밖 피부 지역에서 주목할 수 있습니다.
실제로 UV-내성 천으로 덮인 조절 귀 피부에 비해 UV-B에 노출된 귀 피부는 흑색종 개시의 부담이 높기 때문에 더 높은 색소 침착을 보여줍니다. UV-B의 다른 복용량 마우스 피부와 멜 라 닌 세포 활동에 다른 효과 있을 수 있습니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 조사 용량을 결정하고 최적화하는 것이 중요합니다.
