Протокол, описанный здесь предоставляет следователям метод для изучения устных нейтрофилов в лигатуре индуцированной животной модели пародонта в аналогичной манере для человеческих участников. Основное преимущество этого метода подчеркивается увеличением объема воспаленных тканей десен, доступных для последующего анализа, что снижает использование животных. Наша способность извлекать лиготуры с покрытием биопленки со всего зуба позволяет смеять эффективное лечение локализованной пародонтальной болезни.
Использование этой модели может быть применено в изучении системного воздействия пародонтита в животной модели, в связи с увеличением областей воспаленных тканей десен. Знакомство с использованием микрохирургических инструментов и рассечения микроскопов, а также связывание узлов хирурга до обработки живых животных субъектов, в значительной степени рекомендуется. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение в сокращении длины кривой обучения, необходимой для достижения профессионального размещения лигатуры.
Демонстрацией процедуры будет Джефф Чадвиг, аспирант из моей лаборатории. Начните с позиционирования мыши на нагретой хирургической платформе. После обеспечения правильной анестезии мыши стабилизуйте челюсти и челюсти в открытом положении с помощью резинки.
Поддерживайте шею ватным тампоном для поддержания челюсти в горизонтальном положении и покройте тело и хвост, чтобы уменьшить потерю тепла. Распоитите хирургический микроскоп при желаемом увеличении и освещении полости рта. Используйте осколок типсов для установки стерильных 50 или меньше плетеные шелковые швы вокруг M1 и M2 челюсти моляров в gingival sulcus.
Распоистите дистальный хвост шва на небальную сторону зубного протеза и вставьте проксимальный сегмент между контактом M2 и M3. Затем оберните его вокруг буккала поверхности M2 и вставьте его между контактом M1 и M2. Убедитесь, что оба конца шва вытащил плотно, чтобы загнать его в gingival sulcus. Оберните проксимальный сегмент шва вокруг M1 ниже его высоты контура и вставьте его между контактом M1 и M2. Потяните проксимальный хвост шва плотно, чтобы удалить все слабину. Свяжите концы шва с узлом хирурга и обрезать хвосты как можно более сортируются.
Поместите узел в gingival embrasure между M1 и M2 на дворцовой стороне челюстно-челюстного протеза. Очень важно, чтобы узел, используемый для обеспечения лигатуры является безопасным и в положении, когда он не будет раздражать животное или вмешиваться в mastication. После установки лигатуры снимите мышь с хирургического аппарата и поместите ее в чистую клетку под тепловой лампой, убедившись, что следить за ней до полного выздоровления.
Стерилизовать хирургические инструменты в горячем стеклянном стерилизаторе шарика между каждым животным субъектом. Индивидуально дом каждой мыши с соответствующим экологическим обогащением и позволяют ad libitum доступ к фильтрованной воде и пюре стандартных чау в температуре и влажности контролируемой окружающей среды в течение семи до 11 дней. Когда готовы собрать образцы, используйте пипетку для полоскания полости рта с 100 микролитров стерилизованных четырех градусов по Цельсию PBS без кальция и магния в течение 10 секунд.
Повторите полоскание еще два раза, поместив каждый полоскания в тот же 15 миллилитр конической стерильной пробирки для каждого животного. Запустите содержимое каждой 15-миллилитровой трубки через 40-метровый нейлоновый фильтр сетки в 50 миллилитровую коническую трубку и перенесите фильтрат в новую 15-миллилитровую пробирку. Добавьте 33,3 микролитера 16%paraformaldehyde для облегчения фиксации выборки.
Vortex образцы немедленно и инкубировать их на льду в течение 15 минут. Параформальдегид является наиболее опасным реагентом, используемым в протоколе, и должен обрабатываться с помощью рекомендуемого средства индивидуальной защиты, рекомендованного производителем. После инкубации, заполнить трубку до 15 миллилитров с PBS затем центрифугировать его на 1000xg и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант, повторно приостановить гранулы в один миллилитр буфера FACS при четырех градусах по Цельсию и подсчитать клетки на гемоцитометре или автоматизированной счетчике клеток. Повторите центрифугирование и аспирировать супернатанта. Затем повторно приостанавливайте ячейку гранул в соответствующем объеме буфера FACS для окончательной концентрации от 500 000 до 1 миллиона ячеек на 50 микролитров буфера FACS и перенесите клетки в трубку FACS.
Добавьте один микролитер крысиной сыворотки и два микролитера антител против мыши IGG к 50 микролитров образца. Вихрь образца немедленно и блокировать его на льду в течение 20 минут. Затем добавьте соответствующие антитела к каждому образцу.
Вихрь и инкубировать на льду в течение 30 минут в темноте. После инкубации промойте образцы одним миллилитром буфера FACS, вихрем и центрифугой в течение пяти минут при 1000хг и четырех градусах Цельсия. Свалить супернатант и аккуратно заблокировать открытие трубки FACS.
Повторите стирку дважды, а затем повторно приостановить образцы в 250 микролитров буфера FACS для хранения. Обложка трубки с парафиновой пленкой, оберните их в алюминиевую фольгу, и хранить их при четырех градусах по Цельсию до готовности к анализу. Цитометрия потока была использована для анализа нейтрофилов, восстановленных в результате перорального полоскания от наивной мыши, а также перорального полоскания и восстановленной лигатуры у мыши с лиготическим пародонтитом.
Для оценки альвеолярной потери костной массы, альвеолярные уровни костей были измерены от альвеолярного костного гребня до цементоанамельского соединения для здоровых и лигатированных мышей. Затем были рассчитаны различия в измерении. Хотя не рассмотрены здесь, гистопатологические, иммуногистохимические, и морфометрическая оценка пародонтия и альвеолярной кости также может быть проведена в зависимости от исследовательского вопроса.
Эта модель в настоящее время используется в моей лаборатории для изучения влияния устной врожденной иммунной системы на системное здоровье и болезни.
