Наш протокол обеспечивает простой метод для 3D-культуры клеток и очень подотменен для анализа ниже по течению. Это облегчает оценку неоднородных образцов пациентов и их конкретных ответов на наркотики. Преимущество этого метода заключается в том, что сфероиды могут быть сформированы из небольших клеточных чисел, что позволяет как для сохранения дефицитных первичных образцов, так и высокой пропускной способности скрининга для конкретных пациентов наркотиков ответов.
Модель подвешивания капли создает физиологическую среду с 3D-диффузией препарата и делает реакции, соответствующие стадии опухоли. Это позволяет развиться в области целенаправленной терапии и лечения конкретных пациентов. Этот метод идеально подходит для изучения рака яичников, неоднородности и развития химиоустойчивости.
Тем не менее, он также может быть использован для изучения других видов рака и лекарственно-устойчивых популяций клеток. При обливки сфероидов, важно пипетки точные объемы. Это обеспечивает консистенцию между сфероидами.
Сфероиды и их соответствующие капли по своей сути хрупкие и легко теряются без надлежащей обработки, поэтому мы покажем, как правильно пластины, поддерживать и анализировать висячие пластины падение. Демонстрацией этой процедуры будет Майкл Брегенцер, аспирант нашей лаборатории. Начните с заполнения каждого хорошо из шести-хорошо пластины с четырьмя-пятью миллилитров автоклава деионизированной воды и зажатие висячие пластины падение между крышкой и нижней части пластины.
Добавьте от 800 до 1000 микролитров воды вокруг края подвесной пластины капли, чтобы обеспечить влажную окружающую среду и свести к минимуму испарение. Затем соберите 2D выращенные клетки, отсоединив их трипсином, а затем добавив шесть или восемь миллилитров среды, содержащей FBS. Аспирировать клетки с 10 миллилитров серологических пипетки, и хранение их в 15 миллилитров конической трубки.
Используйте гемоцитометр для подсчета клеток. Подготовьте подвеску клеток в соответствии с рукописными указаниями и аккуратно перемешайте с пипеткой, чтобы обеспечить однородное распределение. Поместите кончик пипетки в колодец под углом 45 градусов и пипетку 20 микролитров подвески в каждую висящую каплю хорошо.
Поместите крышку шести-хорошо пластины обратно и использовать эластичную термопластичную полосу, чтобы запечатать края. Инкубировать в стандартном углекислом газе увлажненной инкубатор и кормить висячие капли каждые два-три дня, добавив два-три микролитров клеточной культуры среды для каждого сфероид-содержащих хорошо. Для количественной оценки пролиферации и жизнеспособности клеток добавьте два микролитера отфильтрованного раствора на основе резазурина к скважинам, предназначенным для анализа распространения и инкубации в соответствии с рукописным направлением.
После инкубации период, открыть висячие сэндвич падение в биобезопасности кабинета и принести 384 хорошо пластины с крышкой еще на месте для пластины читателя. Поместите его в плиту читателя и читать пластины. Сохраните эксперимент в всплывающем окне и экспортируйте данные в электронную таблицу.
Верните пластину обратно в базу из шести хорошо и поместите ее в инкубатор. После того, как все точки времени были прочитаны в течение дня, запечатать пластину перед инкубацией. Для подготовки сфероидов для анализа цитометрии потока используйте трубу из 1000 микролитров, чтобы собрать их из каждой системы и отставить в 15-миллилитровую коническую трубку для дезагрегации.
Подвеска клеток Aliquot в пять микро центрифугных трубок, так что каждая трубка содержит по крайней мере 50 000 клеток. Центрифуга труб на 400 раз G в течение пяти минут в микроцентрифуге, а затем аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров буфера Aldefluor. Этикетка труб в соответствии с рукописными указаниями.
Добавьте 0,5 микролитров изотипа APC в трубку APC ISO и один микролитер антитела CD133 к трубке ALDH CD133. Затем добавьте пять микролитров реагента DEAB и 0,5 микролитров ALDH в трубку DEAB и один микролитер ALDH в трубку ALDH CD133. Vortex все трубы в течение нескольких секунд и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут.
После инкубации, вихрь все трубы снова и центрифуги их в 400 раз G в течение пяти минут. Этикетка FACS труб в соответствии с рукописными указаниями и заполнить изолированный контейнер пены со льдом. Аспирировать супернатант из микроцентрифугных трубок.
Затем повторно приостанавливаю неописуемый контроль в 400 микролитров буфера FACS и остальных ячеек в 400 микролитров буфера FACS DAPI. Поместите трубки на лед, пока они не могут быть проанализированы на цитометре потока. Используйте FlowJo для анализа данных с цитометра потока.
Дважды щелкните необлебряемый файл и установите Y-ось в сторону высоты рассеяния или SSCH и X-оси для перемотки высоты рассеяния или FSCH. Нажмите кнопку T рядом с каждой оси, чтобы настроить шкалу и максимизировать разделение между различными популяциями ячеек. Далее нажмите на кнопку Polygon Gating, нарисуйте полигональные ворота вокруг популяции клеток и обозначите ячейки популяции.
Дважды нажмите на популяцию ячейки в рабочем пространстве, а затем измените ось FSC на ширину FSC и ось SSC на высоту FSC. Выберите прямоугольные ворота, чтобы нарисовать прямоугольник только вокруг левой плотной популяции ячеек, охватывающей всю Y-ось. Наклеить этикетку на эти ворота одиночные ячейки.
Затем нажмите правой кнопкой мыши и скопировать эти клетки в вложенных одиночных ячеек ворот и вставить их под каждый образец в рабочем пространстве. Дважды щелкните ворота Single Cells, вложенные под образцом DAPI, чтобы просмотреть популяцию одной ячейки из этой пробной трубки. Измените канал оси FSC на канал области DAPI и измените канал оси SSC на гистограмму.
Нажмите на кнопку T рядом с оси DAPI и нажмите на Настраивайте ось, чтобы настроить шкалу и максимизировать разделение между положительными DAPI и отрицательными пиками DAPI. Нажмите Применить в всплывающем окне и выбрать кнопку Range Gate. Распределив его по отрицательному пику DAPI и обозначив эти ворота Live Cells.
Копировать живые клетки ворота и вставить его под воротами одной клетки, под APC ISO DEAB и ALDH CD133 труб, чтобы выбрать ту же часть живых клеток в каждой трубке. Затем дважды щелкните популяцию живых ячеек, вложенных под файлом образца APC ISO, и переключите X-ось на область ALDH и Y-ось на область APC. Нанесите квадрантные ворота и отрегулируйте пересечение ворот, например, примерно 0,5% населения находится в левом верхнем левом от окна участка.
Затем назовите квадранты по желанию, затем скопировать и вставить квадрантные ворота на популяцию живых клеток, вложенных под файл DEAB, и отрегулируйте вертикальную линию так, чтобы примерно 0,15% популяции клеток находится в положительном квадранте ALDH. Наконец, копировать и вставлять квадрант ворота в ALDH CD133 файлы Live Cells населения и оценки рака стволовых клеток пропорций на основе ALDH и CD133 пропорций. Этот протокол может быть использован для высокой пропускной способности анализа раковых стволовых клеток, полученных пациентом.
Всего 10 клеток на колодец могут образовывать надежные сфероиды, и по мере распространения клеток сфероиды расширяются в размерах. Емкость пролиферации может быть легко количественно с помощью анализа флоресок на основе резазурина. Влияние препаратов на сфероидную морфологию можно визуализировать с помощью фазовой контрастной визуализации и количественно, сравнивая резазуриновую флуоресценцию в необработанных и обработанных клетках.
Гибель клеток может быть подтверждена путем добавления Calcein-AM и этидия гомодимера I к сфероидам, а затем изображения на конфокальных микроскопов. Наконец, сфероиды могут быть собраны и рассеяны в одну клетку подвески для анализа с потоком цитометрии, что позволяет различить эффективность различных методов лечения наркотиков на конкретных популяциях клеток. Чтобы избежать потери капель, среднего испарения и изменения размера сфероида, важно обращаться с пластинами тщательно, пипетки с точностью и полностью запечатать висячие пластины падения.
Для оценки изменений в экспрессии генов и растворимой сигнализации в связи с медикаментозным лечением, одноклеточное секвенирование РНК и связанные с ферментами иммуносорбентные анализы могут быть использованы для содействия развитию терапии. Этот метод позволяет исследованиям в области онкологии, точной медицины и разработки лекарственных средств для изучения внутри- и межбольгетической неоднородности, а также химиоустойчивости через высокую пропускную способность скрининга наркотиков малых биопсий. При выполнении этого протокола, не забудьте носить все стандартные средства индивидуальной защиты.
Включая перчатки, защитные очки, лабораторные пальто, брюки и обувь с близкого к нося.
