Protokolümüz 3D hücre kültürü için basit bir yöntem sağlar ve downstream analizi için son derece münasiptir. Bu, heterojen hasta örneklerinin ve bunların spesifik ilaç yanıtlarının değerlendirilmesini kolaylaştırır. Bu tekniğin avantajı, küresel lerin küçük hücre sayılarından oluşabilmesi, hem az sayıda birincil numunenin korunmasına hem de hastaya özgü ilaç yanıtları için yüksek iş elde taramasına olanak sağlamasıdır.
Asılı damla modeli 3D ilaç difüzyonu ile fizyolojik bir ortam oluşturur ve tümör aşamasına karşılık gelen yanıtlar yapar. Bu hedeflenen tedaviler ve hastaya özel tedavilerin geliştirilmesine olanak sağlar. Bu yöntem yumurtalık kanseri, heterojenlik ve kemo direnci gelişimi için idealdir.
Ancak, aynı zamanda diğer kanserler ve ilaca dirençli hücre popülasyonları incelemek için kullanılabilir. Spheroidleri kaplamayaparken, pipet hassas hacimleri önemlidir. Bu küresel ler arasında tutarlılık sağlar.
Spheroids ve ilgili damlacıkları doğal olarak kırılgan ve kolayca uygun kullanım olmadan kaybolur, bu nedenle nasıl uygun plaka, korumak ve asılı bir damla plaka analiz gösterecektir. Bu prosedürü gösteren Michael Bregenzer, bizim laboratuvardan bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Otoklav deiyonize su dört ila beş mililitre ile altı kuyu plaka her kuyu doldurarak ve kapak ve plaka nın alt arasında asılı damla plaka sandviç ile başlayın.
Nemli bir ortam sağlamak ve buharlaşmayı en aza indirmek için asılı bırakma plakasının kenarına 800 ila 1000 mikrolitre su ekleyin. Daha sonra, tripsin ile ayırarak 2D yetiştirilen hücreleri toplamak ve daha sonra FBS içeren orta altı veya sekiz mililitre ekleyerek. Hücreleri 10 mililitre serolojik pipetle aspire edin ve 15 mililitrelik konik bir tüpe yatırın.
Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. El yazması talimatlara göre hücre süspansiyonu hazırlayın ve homojen dağılımı sağlamak için pipetle hafifçe karıştırın. Pipetin ucunu kuyudaki 45 derecelik bir açıyla ve pipet20 mikrolitre süspansiyonu her bir askı damlasına yerleştirin.
Altı kuyulu plakanın kapağını tekrar üzerine yerleştirin ve kenarları kapatmak için esnek bir termoplastik şerit kullanın. Standart bir karbondioksit nemlendirilmiş kuvöz de kuluçka ve her küresel içeren kuyu hücre kültürü orta iki ila üç mikrolitre ekleyerek her iki ila üç günde bir asılı damla beslemek. Hücrelerin çoğalmasını ve canlılığını ölçmek için, prolifes analizi için belirlenen kuyulara iki mikrolitre filtrelenmiş resazurin bazlı çözelti ekleyin ve el yazması yönüne göre kuluçkaya yatırın.
Kuluçka döneminden sonra, bir biyogüvenlik kabininde asılı damla sandviç açın ve plaka okuyucu hala yerinde kapağı ile 384 iyi plaka getirmek. Plaka okuyucu yerleştirin ve plaka okuyun. Denemeyi açılır pencereye kaydedin ve verileri elektronik tabloya aktarın.
Tabağı altı kuyulu üsse geri getirin ve kuvöze yerleştirin. Gün boyunca tüm zaman puanları okunduktan sonra, kuluçkadan önce plakayı yeniden kapatın. Akış sitometri analizi için sferoidler hazırlamak için, her kuyudan toplamak ve ayrıştırma için 15 mililitrelik konik tüp içine yatırmak için 1000 mikrolitrelik pipet kullanın.
Aliquot hücre süspansiyon beş mikro santrifüj tüpler ilerler, böylece her tüp en az 50,000 hücre içerir. Tüpleri 400 kez G'de mikrosantrifüjde beş dakika süreyle santrifüj edin, sonra süpernatantı aspire edin ve 100 mikrolitre Aldefluor tamponunda peletleri yeniden askıya alın. Tüpleri el yazması talimatlara göre etiketle.
APC ISO tüpüne 0,5 mikrolitre APC isotip antikor ve ALDH CD133 tüpüne bir mikrolitre CD133 antikor ekleyin. Daha sonra DEAB tüpüne beş mikrolitre DEAB reaktifi ve 0,5 mikrolitre ALDH ve ALDH CD133 tüpüne bir mikrolitre ALDH ekleyin. Girdap birkaç saniye için tüm tüpler ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derece onları kuluçka.
Kuluçkadan sonra, girdap tüm tüpleri tekrar ve santrifüj 400 kez G beş dakika için. Etiket FACS tüpler el yazması talimatlara göre ve buz ile yalıtımlı köpük konteyner doldurun. Mikrosantrifüj tüplerinden süpernatant aspire.
Daha sonra 400 mikrolitre FACS tamponundaki lekesiz kontrolü ve 400 mikrolitre FACS DAPI tamponundaki hücrelerin geri kalanını yeniden askıya alın. Tüpleri bir akış sitometreüzerinde analiz edilene kadar buzun üzerine yerleştirin. Akış sitometresinden gelen verileri analiz etmek için FlowJo'yu kullanın.
Lekelenmemiş dosyayı çift tıklatın ve Y eksenini yan dağılım yüksekliğine veya SSCH'e ve X eksenini ileri dağılım yüksekliğine veya FSCH'ye ayarlayın. Ölçeği ayarlamak ve farklı hücre popülasyonları arasındaki ayrımı en üst düzeye çıkarmak için her eksenin yanındaki T düğmesini tıklatın. Ardından, Çokgen Gating düğmesine tıklayın, hücre popülasyonu etrafında çokgen kapı çizin ve popülasyon Hücreleri etiketleyin.
Çalışma alanında hücrenin popülasyonuna çift tıklayın ve ardından FSC eksenini FSC genişliğine, SSC eksenini de FSC yüksekliğine değiştirin. Yalnızca tüm Y eksenini kapsayan en yoğun hücre popülasyonunun etrafına dikdörtgen çizmek için dikdörtgen kapısını seçin. Bu kapıyı tek hücreolarak etiketle.
Ardından, iç içe geçmiş Tek Hücreler kapısındabu Hücreleri sağ tıklatın ve kopyalayın ve çalışma alanındaki her örneğin altına yapıştırın. Bu örnek tüpten tek hücre popülasyonu görüntülemek için DAPI örneğinin altında iç içe olan Tek Hücreler kapısını çift tıklatın. FSC eksen kanalını DAPI alan kanalına değiştirin ve SSC eksen kanalını histogramla değiştirin.
DAPI ekseninin yanındaki T düğmesine tıklayın ve ölçeği ayarlamak ve DAPI pozitif ve DAPI negatif zirveleri arasındaki ayrımı en üst düzeye çıkarmak için Ekseni Özelleştir'i tıklatın. Açılan pencerede Uygula'yı tıklatın ve Aralık Kapısı düğmesini seçin. DAPI negatif tepe üzerine yayın ve bu kapı Live Cells etiket.
Canlı Hücreler kapısını kopyalayın ve her tüpteki canlı hücrelerin aynı kısmını seçmek için APC ISO DEAB ve ALDH CD133 tüpleri altında Tek Hücreler kapısının altına yapıştırın. Ardından, APC ISO örnek dosyasının altında yuvalanmış Canlı Hücreler popülasyonuna çift tıklayın ve X eksenini ALDH alanına, Y eksenini de APC alanına geçin. Çeyreğin kapağını uygulayın ve nüfusun yaklaşık %0,5'inin çizim penceresinin sol üst kısmında olması gibi kapının kesişimini ayarlayın.
Daha sonra kadranda istedikleri gibi isim ver, sonra deab dosyasının altında yuvalanmış canlı hücre popülasyonuna çeyrek kapıları kopyalayıp yapıştırın ve hücre popülasyonunun yaklaşık %0,15'inin ALDH pozitif kadranda yaşaması için dikey çizgiyi ayarlayın. Son olarak, kopyalayın ve ALDH CD133 dosyaları Live Cells nüfus ve değerlendirme kanser kök hücre oranları ALDH ve CD133 oranlarına dayalı çeyrek kapıları yapıştırın. Bu protokol, hasta kaynaklı kanser kök hücrelerinin yüksek iş analizi için kullanılabilir.
Her biri 10 kadar az hücre güvenilir küreseloidler oluşturabilir ve hücreler çoğaldınkça, küresellerin boyutları genişler. Proliferasyon kapasitesi resazurin bazlı floresan tetkik ile kolayca ölçülebilir. İlaçların küresel morfoloji üzerindeki etkisi faz kontrastgörüntüleme ile görüntülenebilir ve tedavi edilmeyen ve tedavi edilmeyen hücrelerde resazurin floresanskarşılaştırılarak ölçülebilir.
Hücre ölümü Calcein-AM ve ethidium homodimer I'in küresel olarak eklenmesiyle doğrulanabilir ve ardından konfokal mikroskopta görüntüleme yapılabilir. Son olarak, sferoidler hasat edilebilir ve akış sitometrisi ile analiz için tek bir hücre süspansiyon içine dağıtılabilir, hangi mümkün belirli hücre popülasyonları üzerinde farklı ilaç tedavileri etkinliğini ayırt etmek için yapar. Damlacık kaybını, orta buharlaşmayı ve küresel boyuttaki değişimi önlemek için plakalarınızı dikkatli bir şekilde, pipetle hassas bir şekilde işlemek ve asılı bırakma plakalarınızı tamamen mühürlemek önemlidir.
Gen ekspresyonundaki değişiklikleri ve ilaç tedavisine bağlı çözünür sinyalizasyondaki değişiklikleri değerlendirmek için, tek hücreli RNA dizilimi ve enzime bağlı immünosorbent tahlilleri, terapötik lerin gelişimini kolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu teknik, küçük biyopsilerin yüksek iş yapma ilaç taraması yoluyla kemoterapi direncinin yanı sıra hastalar arası heterojenliği de araştırmak için onkoloji, hassas tıp ve ilaç geliştirme araştırmalarına olanak sağlar. Bu protokolü gerçekleştirirken, tüm standart kişisel koruyucu ekipmanları taktığından emin olun.
Eldivenler, güvenlik gözlükleri, laboratuvar önlükleri, pantolonlar ve yakın ayakkabılar dahil.
