Notre protocole fournit une méthode simple pour la culture cellulaire 3D et est très agréable à l’analyse en aval. Cela facilite l’évaluation d’échantillons hétérogènes de patients et de leurs réponses médicamenteuses spécifiques. L’avantage de cette technique est que les sphéroïdes peuvent être formés à partir de petits nombres de cellules, permettant à la fois la conservation d’échantillons primaires rares, et le criblage à haut débit pour les réponses médicamenteuse spécifiques au patient.
Le modèle de chute suspendue crée un environnement physiologique avec la diffusion de drogue 3D et fait des réponses correspondant au stade de tumeur. Cela permet le développement de thérapies ciblées et de traitements spécifiques aux patients. Cette méthode est idéale pour étudier le cancer de l’ovaire, l’hétérogénéité et le développement de la résistance à la chimio.
Cependant, il peut également être utilisé pour étudier d’autres cancers et des populations de cellules résistantes aux médicaments. Lors du placage des sphéroïdes, il est important de pipette volumes précis. Cela assure la cohérence entre les sphéroïdes.
Les sphéroïdes et leurs gouttelettes respectives sont intrinsèquement fragiles et facilement perdus sans manipulation adéquate, c’est pourquoi nous montrerons comment plaquer, entretenir et analyser de manière appropriée une plaque de chute suspendue. Michael Bregenzer, un étudiant diplômé de notre laboratoire, démontrera cette procédure. Commencez par remplir chaque puits de la plaque de six puits de quatre à cinq millilitres d’eau déionisée autoclave et en sandwich la plaque de chute suspendue entre le couvercle et le fond de la plaque.
Ajouter 800 à 1000 microlitres d’eau autour du bord de la plaque de chute suspendue pour fournir un environnement humide et minimiser l’évaporation. Ensuite, recueillir les cellules cultivées en 2D en les détachant avec de la trypsine, puis en ajoutant six ou huit millilitres de milieu contenant FBS. Aspirez les cellules avec la pipette sérologique de 10 millilitres, et déposez-les dans un tube conique de 15 millilitres.
Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. Préparer la suspension cellulaire selon les directives du manuscrit et mélanger délicatement avec la pipette pour assurer une distribution homogène. Placez la pointe de la pipette dans le puits à un angle de 45 degrés et pipette 20 microlitres de suspension dans chaque goutte suspendue bien.
Remettre le couvercle de la plaque à six puits et utiliser une bande thermoplastique extensible pour sceller les bords. Incuber dans un incubateur humidifié standard de dioxyde de carbone et nourrir les gouttes suspendues tous les deux à trois jours en ajoutant deux à trois microlitres de milieu de culture cellulaire à chaque puits contenant des sphéroïdes. Pour quantifier la prolifération et la viabilité des cellules, ajoutez deux microlitres de solution filtrée à base de resazurine aux puits désignés pour l’analyse de la prolifération et incubent selon la direction manuscrite.
Après la période d’incubation, ouvrez le sandwich suspendu dans une armoire de biosécurité et apportez la plaque de puits 384 avec le couvercle toujours en place pour le lecteur de plaque. Placez-le dans le lecteur de plaque et lisez la plaque. Enregistrez l’expérience dans la fenêtre popup et exportez les données dans une feuille de calcul.
Remettre la plaque à la base de six puits et la placer dans l’incubateur. Une fois que tous les points de temps ont été lus pour la journée, réséaliser la plaque avant d’incuber. Pour préparer les sphéroïdes à l’analyse de la cytométrie d’écoulement, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour les recueillir de chaque puits et les déposer dans un tube conique de 15 millilitres pour la désagrégation.
La suspension cellulaire d’Aliquot en cinq tubes de micro centrifugeuse pour que chaque tube contienne au moins 50 000 cellules. Centrifugez les tubes à 400 fois G pendant cinq minutes dans une microcentrifugeuse, puis aspirez le supernatant et suspendez les granulés dans 100 microlitres de tampon Aldefluor. Étiquetez les tubes selon les instructions manuscrites.
Ajouter 0,5 microlitres d’anticorps isotype APC au tube ISO APC et un microlitre d’anticorps CD133 au tube ALDH CD133. Ajoutez ensuite cinq microlitres de réaccentrement DEAB et 0,5 microlitres d’ALDH au tube DEAB et un microlitre d’ALDH au tube ALDH CD133. Vortex tous les tubes pendant quelques secondes et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes.
Après l’incubation, vortex tous les tubes à nouveau et les centrifuger à 400 fois G pendant cinq minutes. Étiquetez les tubes FACS selon les instructions manuscrites et remplissez un récipient isolé en mousse de glace. Aspirer le supernatant des tubes de microcentrifugeuse.
Puis suspendre à nouveau le contrôle non taché dans 400 microlitres de tampon FACS et le reste des cellules dans 400 microlitres de tampon FACS DAPI. Placez les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils puissent être analysés sur un cytomètre d’écoulement. Utilisez FlowJo pour analyser les données du cytomètre d’écoulement.
Double cliquez sur le fichier non taché et réglez l’axe Y à la hauteur de dispersion latérale ou SSCH et l’axe X pour avancer la hauteur de dispersion ou FSCH. Cliquez sur le bouton T à côté de chaque axe pour ajuster l’échelle et maximiser la séparation entre les différentes populations cellulaires. Ensuite, cliquez sur le bouton Polygon Gating, dessinez la porte polygone autour de la population cellulaire et étiquetez la population cellules.
Cliquez deux fois sur la population de la cellule dans l’espace de travail, puis changez l’axe FSC en largeur FSC et l’axe SSC à la hauteur FSC. Choisissez la porte du rectangle pour dessiner seulement un rectangle autour de la population dense la plus à gauche des cellules, couvrant l’ensemble de l’axe Y. Étiquetez cette porte Single Cells.
Puis cliquez à droite et copiez cette cellule dans la porte des cellules individuelles imbriquées et coller sous chaque échantillon dans l’espace de travail. Cliquez deux fois sur la porte cellules simples imbriquées sous l’échantillon DAPI pour afficher la population de cellules individuelles à partir de ce tube d’échantillon. Modifiez le canal de l’axe FSC vers le canal de zone DAPI et changez le canal de l’axe SSC en histogramme.
Cliquez sur le bouton T à côté de l’axe DAPI et cliquez sur Personnaliser l’axe pour ajuster l’échelle et maximiser la séparation entre les pics négatifs DAPI positifs et DAPI. Cliquez sur Appliquer dans la fenêtre popup et choisissez le bouton Range Gate. Répartir sur le pic négatif DAPI et étiqueter cette porte Cellules vivantes.
Copiez la porte Cellules vivantes et coller sous la porte Cellules simples, sous les tubes APC ISO DEAB et ALDH CD133, pour sélectionner la même partie des cellules vivantes dans chaque tube. Cliquez ensuite deux fois sur la population de cellules vivantes imbriquées sous le fichier d’échantillon ISO de l’APC, et passez de l’axe X à la zone ALDH et à l’axe Y vers la zone APC. Appliquez la porte quadrant et ajustez l’intersection de la porte de telle sorte qu’environ 0,5 % de la population se trouve en haut à gauche de la fenêtre de la parcelle.
Nommez ensuite les quadrants comme vous le souhaitez, puis copiez et coller les portes du quadrant sur la population de cellules vivantes imbriquées sous le fichier DEAB et ajustez la ligne verticale de sorte qu’environ 0,15 % de la population cellulaire se trouve dans le quadrant positif de l’ALDH. Enfin, copier et coller les portes quadrant à l’ALDH CD133 fichiers Live Cells population et l’évaluation des proportions de cellules souches cancéreuses basées sur ALDH et CD133 proportions. Ce protocole peut être utilisé pour l’analyse à haut débit des cellules souches cancéreuses dérivées du patient.
Aussi peu que 10 cellules par puits peuvent former des sphéroïdes fiables et que les cellules prolifèrent, les sphéroïdes se dilatent en taille. La capacité de prolifération peut être facilement quantifiée avec un essai de florescence à base de résazurine. L’effet des médicaments sur la morphologie sphéroïde peut être visualisé avec l’imagerie par contraste de phase et quantifié en comparant la florescence de la résazurine dans les cellules non traitées et traitées.
La mort cellulaire peut être validée par l’ajout de Calcein-AM et d’ethidium homodimer I aux sphéroïdes, suivie de l’imagerie au microscope confocal. Enfin, les sphéroïdes peuvent être récoltés et dispersés en une seule suspension cellulaire pour analyse avec cytométrie d’écoulement, ce qui permet de discerner l’efficacité des différents traitements médicamenteux sur des populations cellulaires spécifiques. Pour éviter la perte de gouttelettes, l’évaporation moyenne et la variation de la taille des sphéroïdes, il est important de manipuler vos assiettes avec soin, pipette avec précision et sceller complètement vos plaques de chute suspendues.
Pour évaluer les changements dans l’expression des gènes et la signalisation soluble due au traitement médicamenteux, le séquençage de l’ARN unicelliste et les analyses immunosorbents liées aux enzymes peuvent être utilisés pour faciliter le développement de thérapeutiques. Cette technique permet aux recherches en oncologie, en médecine de précision et en développement de médicaments d’explorer l’hétérogénéité intra-et inter-patients ainsi que la résistance à la chimio grâce au criblage de médicaments à haut débit de petites biopsies. Lors de l’exécution de ce protocole, assurez-vous de porter tout l’équipement de protection individuelle standard.
Y compris des gants, des lunettes de sécurité, des manteaux de laboratoire, des pantalons et des chaussures à bouts fermés.
