Nosso protocolo fornece um método simples para a cultura celular 3D e é altamente favorável à análise a jusante. Isso facilita a avaliação de amostras heterogêneas de pacientes e suas respostas específicas de medicamentos. A vantagem desta técnica é que os esferoides podem ser formados a partir de pequenos números de células, permitindo tanto a preservação de amostras primárias escassas, quanto a triagem de alto rendimento para respostas de medicamentos específicos do paciente.
O modelo de queda de enforcamento cria um ambiente fisiológico com difusão de medicamentos 3D e faz respostas correspondentes ao estágio tumoral. Isso permite o desenvolvimento de terapias-alvo e tratamentos específicos para o paciente. Este método é ideal para estudar câncer de ovário, heterogeneidade e desenvolvimento da resistência à quimioterapia.
No entanto, também pode ser usado para estudar outros cânceres e populações de células resistentes a medicamentos. Ao emplaar esferoides, é importante pipetizar volumes precisos. Isso garante consistência entre os esferoides.
Os esferoides e suas respectivas gotículas são inerentemente frágeis e facilmente perdidos sem o manuseio adequado, por isso mostraremos como emplacar, manter e analisar adequadamente uma placa de gota pendurada. Demonstrando este procedimento será Michael Bregenzer, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Comece preenchendo cada poço da placa de seis poços com quatro a cinco mililitros de água desionizada autoclave e sanduiche a placa de gota pendurada entre a tampa e o fundo da placa.
Adicione 800 a 1000 microlitros de água ao redor da borda da placa de gota suspensa para fornecer um ambiente úmido e minimizar a evaporação. Em seguida, colete células cultivadas em 2D, destacando-as com trippsina e, em seguida, adicionando seis ou oito mililitros de FBS médios. Aspire as células com a pipeta sorológica de 10 mililitros, e deposite-as em um tubo cônico de 15 mililitros.
Use um hemótmetro para contar as células. Prepare a suspensão celular de acordo com as instruções do manuscrito e misture suavemente com a pipeta para garantir a distribuição homogênea. Coloque a ponta da pipeta no poço em um ângulo de 45 graus e pipeta 20 microliters de suspensão em cada gota bem pendurada.
Coloque a tampa da placa de seis poços de volta e use uma tira termoplástica elástica para selar as bordas. Incubar em uma incubadora padrão de dióxido de carbono umidificada e alimentar as gotas de enforcamento a cada dois ou três dias adicionando dois a três microliters de cultura celular média a cada poço contendo esferoides. Para quantificar a proliferação e a viabilidade das células, adicione dois microliters de solução filtrada baseada em resazurina aos poços designados para análise de proliferação e incubam de acordo com a direção do manuscrito.
Após o período de incubação, abra o sanduíche de gota pendurada em um armário de biossegurança e leve a placa 384 com a tampa ainda no lugar para o leitor de pratos. Coloque-o no leitor de placas e leia a placa. Salve o experimento na janela pop-up e exporte os dados para uma planilha.
Volte a placa de volta para a base de seis poços e coloque-a na incubadora. Uma vez que todos os pontos de tempo tenham sido lidos para o dia, reseeal a placa antes de incubar. Para preparar esferoides para análise de citometria de fluxo, use uma pipeta de 1000 microliteres para recolhê-los de cada poço e depositá-los em um tubo cônico de 15 mililitros para desagregação.
Suspensão de células de aliquot em cinco tubos de micro centrífugas de modo que cada tubo contém pelo menos 50.000 células. Centrifugar os tubos a 400 vezes G durante cinco minutos em um microcentrifuuge, em seguida, aspirar as pelotas supernascer e suspender novamente em 100 microliters de tampão Aldefluor. Rotule os tubos de acordo com as instruções do manuscrito.
Adicione 0,5 microliters de anticorpo isótipo APC ao tubo APC ISO e um microliter de anticorpo CD133 ao tubo ALDH CD133. Em seguida, adicione cinco microliters de reagente DEAB e 0,5 microliters de ALDH ao tubo DEAB e um microliter de ALDH ao tubo ALDH CD133. Vórtice todos os tubos por alguns segundos e incuba-los a 37 graus celsius por 45 minutos.
Após a incubação, o vórtice todos os tubos novamente e centrifuá-los a 400 vezes G por cinco minutos. Rotule os tubos FACS de acordo com as instruções do manuscrito e encha um recipiente de espuma isolado com gelo. Aspire o supernascer dos tubos de microcentrifuuagem.
Em seguida, suspenda novamente o controle não manchado em 400 microliters de tampão FACS e o resto das células em 400 microliters de tampão FACS DAPI. Coloque os tubos no gelo até que possam ser analisados em um citómetro de fluxo. Use o FlowJo para analisar os dados do citómetro de fluxo.
Clique duas vezes no arquivo não identificado e defina o eixo Y para a altura de dispersão lateral ou SSCH e o eixo X para a altura de dispersão para a frente ou FSCH. Clique no botão T ao lado de cada eixo para ajustar a escala e maximizar a separação entre diferentes populações celulares. Em seguida, clique no botão Polygon Gating, desenhe o portão do polígono em torno da população celular e rotule as células da população.
Clique duas vezes na população da célula no espaço de trabalho e, em seguida, altere o eixo FSC para a largura FSC e o eixo SSC para a altura FSC. Escolha o portão retângulo para desenhar apenas um retângulo em torno da população mais densa densa das células, abrangendo todo o eixo Y. Rotule este portão de células únicas.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse e copie estas células no portão de células únicas aninhadas e cole-as sob cada amostra no espaço de trabalho. Clique duas vezes no portal Células Únicas aninhados sob a amostra DAPI para visualizar a população de células únicas desse tubo amostral. Altere o canal do eixo FSC para o canal de área DAPI e altere o canal do eixo SSC para histograma.
Clique no botão T ao lado do eixo DAPI e clique em Personalizar o Eixo para ajustar a escala e maximizar a separação entre os picos negativos DAPI e DAPI. Clique em Aplicar na janela pop-up e escolha o botão Range Gate. Espalhe-o sobre o pico negativo da DAPI e rotule este portão Live Cells.
Copie o portão live cells e cole-o sob o portão de Células Únicas, sob os tubos APC ISO DEAB e ALDH CD133, para selecionar a mesma porção de células vivas em cada tubo. Em seguida, clique duas vezes na população de Células Vivas aninhadas sob o arquivo de amostra ISO APC e mude o eixo X para a área de ALDH e o eixo Y para a área APC. Aplique o Portão do Quadrante e ajuste a intersecção do portão, como a de aproximadamente 0,5% da população, no canto superior esquerdo da janela do lote.
Em seguida, nomeie os quadrantes como desejado, depois copie e cole os portões do quadrante na população de células vivas aninhadas sob o arquivo DEAB e ajuste a linha vertical para que aproximadamente 0,15% da população celular esteja dentro do quadrante positivo da ALDH. Por fim, copie e cole os portões do quadrante para os arquivos ALDH CD133 população de Células Vivas e avaliação de proporções de células-tronco cancerígenas com base em proporções ALDH e CD133. Este protocolo pode ser usado para análise de alto rendimento de células-tronco cancerígenas derivadas do paciente.
Apenas 10 células por poço podem formar esferoides confiáveis e à medida que as células se proliferam, os esferoides se expandem em tamanho. A capacidade de proliferação pode ser facilmente quantificada com um ensaio de floresnce baseado em resazurina. O efeito de drogas na morfologia esferoide pode ser visualizado com imagens de contraste de fase e quantificado comparando a florescência de resazurina em células não tratadas e tratadas.
A morte celular pode ser validada através da adição de Calcein-AM e do homodimer de ethidium I aos esferoides, seguido por imagens em um microscópio confocal. Finalmente, os esferoides podem ser colhidos e dispersos em uma única suspensão de células para análise com citometria de fluxo, o que torna possível discernir a eficácia de diferentes tratamentos medicamentosos em populações celulares específicas. Para evitar a perda de gotículas, evaporação média e variação no tamanho do esferoide, é importante manusear as placas com cuidado, pipeta com precisão e selar completamente as placas de gota suspensa.
Para avaliar mudanças na expressão genética e sinalização solúvel devido ao tratamento medicamentoso, o sequenciamento de RNA de células únicas e ensaios imunossorbentes ligados à enzima podem ser usados para facilitar o desenvolvimento de terapêuticas. Esta técnica permite que pesquisas em oncologia, medicina de precisão e desenvolvimento de medicamentos explorem a heterogeneidade intra e inter paciente, bem como a resistência à quimioterapia através de rastreamento de medicamentos de alto rendimento de pequenas biópsias. Ao executar este protocolo, certifique-se de usar todos os equipamentos de proteção individual padrão.
Incluindo luvas, óculos de segurança, jalecos, calças e sapatos de perto.
