당사의 프로토콜은 3D 세포 배양을 위한 간단한 방법을 제공하며 다운스트림 분석에 매우 적합합니다. 이것은 이기종 환자 견본 및 그들의 특정 약 반응의 평가를 용이하게 합니다. 이 기술의 장점은 스페로이드가 작은 세포 수에서 형성될 수 있다는 것입니다, 부족한 1차 샘플의 보존을 모두 허용하고, 환자 특정 약물 반응을 위한 높은 처리량 검열.
매달려 있는 낙하 모델은 3D 약물 확산을 통해 생리환경을 조성하고 종양 단계에 대응하는 반응을 한다. 이것은 표적으로 한 치료 및 환자 특정 처리의 발달을 허용합니다. 이 방법은 난소암, 이질성 및 화학 요법의 발달을 연구하는 데 이상적입니다.
그러나, 그것은 또한 다른 암 및 약물 내성 세포 인구를 공부 하기 위해 사용할 수 있습니다. 스페로이드를 도금할 때는 정확한 볼륨을 피펫하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 스페로이드 간의 일관성이 보장됩니다.
스페로이드와 각각의 물방울은 본질적으로 깨지기 쉽고 적절한 처리없이 쉽게 손실되므로 매달려 있는 드롭 플레이트를 적절하게 플레이트, 유지 및 분석하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 대학원생 마이클 Bregenzer 될 것입니다. 6웰 플레이트의 각 우물을 4~5밀리리터의 오토클레이온 워터로 채우고 뚜껑과 접시 바닥 사이에 매달려 있는 드롭 플레이트를 끼우는 것으로 시작합니다.
매달려 있는 낙하판의 테두리 주위에 800~1,000마이크로리터의 물을 첨가하여 습한 환경을 제공하고 증발을 최소화합니다. 다음으로 트립신으로 분리한 다음 FBS를 함유하는 배지의 6~8밀리리터를 추가하여 2D 성장세포를 수집합니다. 10 밀리리터 세로지피트로 세포를 흡인하고 15 밀리리터 원판 튜브에 보관하십시오.
혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 원고 방향에 따라 셀 서스펜션을 준비하고 파이펫과 부드럽게 섞어 균일한 분포를 보장합니다. 파이펫 끝을 45도 각도로 우물에 놓고 각 매달려 있는 각 매달려 있는 양면에 서스펜션 20 마이크로리터를 놓습니다.
6웰 플레이트뚜껑을 다시 놓고 신축성 있는 열가소성 스트립을 사용하여 가장자리를 밀봉합니다. 표준 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양하고 각 스페로이드 함유 우물에 세포 배양 배지의 2 ~3 마이크로 리터를 추가하여 2 ~ 3 일마다 매달려 방울을 공급합니다. 세포의 증식 및 생존가능성을 정량화하기 위해, 증식 분석을 위해 지정된 우물에 여과된 레사쥐린 기반 용액의 2마이크로리터를 추가하고 원고 방향에 따라 배양한다.
인큐베이션 기간 이후에는 생리용 캐비닛에 매달려 있는 드롭 샌드위치를 열고 뚜껑이 있는 384웰 플레이트를 플레이트 판독기에 놓습니다. 접시 판독기에 놓고 접시를 읽습니다. 실험을 팝업 창에 저장하고 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
접시를 6웰 베이스로 돌려놓고 인큐베이터에 놓습니다. 하루 동안 모든 시간 점을 읽은 후 배양하기 전에 접시를 다시 봉인하십시오. 유동 세포 측정 분석을 위해 스페로이드를 준비하려면 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 각 우물에서 수집하여 분리를 위해 15 밀리리터 원간 튜브에 보관하십시오.
각 튜브가 적어도 50, 000 세포를 포함되도록 5 개의 마이크로 원심 분리 관으로 Aliquot 세포 현탁액. 마이크로센트심분리기에서 5분 동안 400회 G로 튜브를 원심분리한 다음, 수퍼를 흡인하고 알데플루오 버퍼 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 원고 의 지시에 따라 튜브에 레이블을 지정합니다.
APC ISO 튜브에 APC 이소타입 항체의 0.5 마이크로리터와 ALDH CD133 튜브에 CD133 항체의 마이크로리터 1개를 추가한다. 그런 다음 DEAB 시약 5개 소리터와 ALDH의 0.5 마이크로리터를 DEAB 튜브에 추가하고 ALDH CD133 튜브에 ALDH의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 모든 튜브를 몇 초 동안 소용돌이시키고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 모든 튜브를 다시 소용돌이시키고 원심분리기를 400회 G로 5분간 분리합니다. 원고 방향에 따라 FACS 튜브에 라벨을 부착하고 절연 된 거품 용기를 얼음으로 채웁니다. 마이크로 원심 분리기 튜브에서 상체를 흡인.
그런 다음 FACS 버퍼400 마이크로리터및 나머지 세포에서 FACS DAPI 버퍼의 400 마이크로리터에서 스테인드 되지 않은 제어를 다시 중단한다. 유동 세포계에서 분석될 때까지 튜브를 얼음 위에 놓습니다. FlowJo를 사용하여 유동 사이토미터의 데이터를 분석합니다.
스테인드되지 않은 파일을 두 번 클릭하고 Y축을 측면 분산 높이 또는 SSCH 및 X축으로 설정하여 분산 높이 또는 FSCH를 전달합니다. 각 축 옆의 T 버튼을 클릭하여 축을 조정하고 서로 다른 셀 집단 간의 분리를 최대화합니다. 다음으로 다각형 게이팅 버튼을 클릭하고 셀 모집단 주위에 다각형 게이트를 그리고 인구 셀에 레이블을 지정합니다.
작업 영역에서 셀의 채우기를 두 번 클릭한 다음 FSC 축을 FSC 너비로 변경하고 SSC 축을 FSC 높이로 변경합니다. 사각형 게이트를 선택하여 전체 Y축에 걸쳐 가장 밀도가 높은 셀 집단 주위에 사각형만 그립니다. 이 게이트 단일 셀에 레이블을 지정합니다.
그런 다음 중첩된 단일 셀 게이트에서 이 셀을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사하여 작업 공간의 각 샘플 아래에 붙여 넣습니다. DAPI 샘플 아래에 중첩된 단일 셀 게이트를 두 번 클릭하여 해당 샘플 튜브에서 단일 셀 모집단을 봅니다. FSC 축 채널을 DAPI 영역 채널로 변경하고 SSC 축 채널을 히스토그램으로 변경합니다.
DAPI 축 옆의 T 버튼을 클릭하고 사용자 지정 축을 클릭하여 축을 조정하고 DAPI 양수와 DAPI 음수 피크 사이의 분리를 최대화합니다. 팝업 창에서 적용을 클릭하고 범위 게이트 버튼을 선택합니다. DAPI 네거티브 피크 위에 확산하고 이 게이트 라이브 셀에 레이블을 지정합니다.
살아있는 세포 게이트를 복사하고 APC ISO DEAB 및 ALDH CD133 튜브 아래단일 셀 게이트 아래에 붙여 넣으며 각 튜브에서 라이브 셀의 동일한 부분을 선택합니다. 그런 다음 APC ISO 샘플 파일 아래에 중첩된 라이브 셀 채우기를 두 번 클릭하고 X축을 ALDH 영역및 Y축영역으로 전환합니다. 사분면 게이트를 적용하고 인구의 약 0.5 %가 플롯 창의 왼쪽 상단에 있는 것과 같이 게이트의 교차점을 조정합니다.
그런 다음 사분면의 이름을 원하는 대로 지정한 다음, DEAB 파일 아래에 중첩된 라이브 셀 인구에 사분면 게이트를 복사하고 붙여 넣고 수직 선을 조정하여 세포 인구의 약 0.15%가 ALDH 양성 사분면 내에 놓이도록 합니다. 마지막으로, ALDH CD133 파일에 사분면 게이트를 복사하여 붙여넣기 라이브 셀 인구와 ALDH 및 CD133 비율에 따라 암 줄기 세포 비율을 평가한다. 이 프로토콜은 환자 유래 암 줄기 세포의 높은 처리량 분석을 위해 사용될 수 있다.
우물 당 10 세포가 신뢰할 수있는 스페로이드를 형성 할 수 있으며 세포가 증식할 때 스페로이드의 크기가 확장됩니다. 증식 용량은 레자쥐린 기반의 플로레스세이센 분석으로 쉽게 정량화될 수 있습니다. 스페로이드 형태에 대한 약물의 효과는 치료되지 않은 치료 및 처리 된 세포에서 resazurin 꽃집을 비교하여 위상 대비 이미징으로 시각화하고 정량화 할 수 있습니다.
세포 사멸은 칼신-AM과 에디듐 호모이머 I를 스페로이드에 첨가하여 검증할 수 있으며, 이어서 공초점 현미경에 대한 이미징이 뒤따릅니다. 마지막으로, 스페로이드는 유동 세포측정을 사용하여 분석을 위해 단일 세포 현탁액으로 수확및 분산될 수 있으며, 이는 특정 세포 집단에 대한 다른 약물 치료의 효과를 분별할 수 있게 한다. 물방울 손실, 중간 증발 및 스페로이드 크기의 변화를 피하기 위해 플레이트를 신중하게 처리하고 파이펫을 정밀하게 처리하고 매달려 있는 드롭 플레이트를 완전히 밀봉하는 것이 중요합니다.
약물 치료, 단세포 RNA 염기서열 분석 및 효소 연계 면역소벤트 분석으로 인한 유전자 발현 및 수용성 신호의 변화를 평가하기 위해 치료법의 개발을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 종양학, 정밀 의학 및 약물 개발에 있는 연구가 작은 생검의 높은 처리량 약 검열을 통해 내과 간 환자 이질성 뿐만 아니라 화학 저항을 탐구하는 것을 허용합니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 모든 표준 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.
장갑, 안전 안경, 실험실 코트, 바지 및 가까운 신발포함.
