Хотя ангиопластика помогает пациентам с ишемической болезнью сердца, сердечно-сосудистые события все еще могут произойти после процедуры. Поскольку МЦР и растворимые молекулы получаются из коронарной циркуляции, они могут быть соотнесены со степенью повреждения и восстановления сосудов. Поэтому коронарные MPC и растворимые уровни посредника могут быть использованы для оценки сердечно-сосудистых событий и прогноза у пациентов с ишемической болезнью сердца, перенесших ишемическую ангиопластику.
MPCs и растворимые молекулы могут также быть использованы для оценки осложнений и прогнозов, которые происходят в различных ишемических условиях, таких как рецидивирующий ишемический инсульт конечностей. Демонстрация процедуры будет Эдуардо Вера-Гомес и Алехандро Эрнандес-Патрисио, лаборанты, и Карен Де Ла Вега-Морено и Карлос Замора-Алеман, студенты-студенты. Также будут продемонстрирована Габриэла Александра Домингес-Перес, студент магистратуры, Альберто Мельхор-Лопес, аспирант, и Марио Антонио Тельес-Гонсалес, сотрудник магистра наук.
В течение одного часа после сбора, передача шести миллилитров собранного образца крови в 15 миллилитров конической трубки и разбавить кровь на один к одному соотношению в PBS. Добавьте два миллилитров градиента плотности среднего до трех пробирок и тщательно перенесите три равных алицита разбавленной крови в каждую трубку градиентной среды плотности. Разделит клетки по центрифугации и перенесите ячейки на интерфейсе в новую трубку.
Вымойте собранные клетки один раз в два миллилитров PBS в течение шести минут, а затем шесть моет в двух миллилитров свежего PBS за стирку в течение двух минут. После последнего мытья, повторно приостановить MPC-содержащих клеток гранулы в один миллилитр PBS для подсчета и добавить один раз десять к шести клеткам помечены пять миллилитров потока цитометрии труб. Пеллет клетки центрифугации и добавить 100 микролитров соответствующих антител интереса, разбавленных в растворе инкубации антител к каждой трубке.
Аккуратно смешайте клетки с каждым добавленным антителом коктейль в течение 10 секунд, и поместите образцы на четыре градуса по Цельсию, защищенные от света, в течение 20 минут. В конце инкубации центрифугировать образцы и повторно приостановить гранулы в 500 микролитров PBS дополняется двумя миллимолярной ЭДТА. Используя элементы управления, соотносящиеся с изотипом, для настройки фонового окрашивания, анализируйте образцы по цитометрии потока в соответствии со стандартными протоколами, загоняя лимфоциты в участке бокового рассеяния, чтобы исключить остаточные гранулоциты, клеточный мусор и другие частицы.
Установите ворота, чтобы содержать большое количество ячеек с CD45-положительным CD34-положительным фенотипом. Далее, используйте CD45-положительный CD34-положительные ворота, чтобы выбрать для киназы вставить доменный рецептор CD133 или CD184-положительные клетки. Затем поднаселения MPC могут быть идентифицированы по их конкретным маркерам поверхности клеток и сообщены в процентах от закрытых событий.
Для определения концентрации растворимых биомаркеров в собранных образцах крови, во-первых, мыть соответствующие предварительно покрытые пластины ELISA два раза с комплектом при условии мыть буфера и этикетки стандарта, образца и контрольных труб. Центрифуга крови, чтобы отделить компоненты крови и aliquot плазмы в образец труб. Передача стандартов, образцов и элементов управления в соответствующие скважины и уплотнения и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 90 минут.
В конце инкубации, отбросить содержимое колодец и добавить антитела обнаружения биотина к каждой хорошо. После одного часа инкубации при 37 градусах по Цельсию, отбросить содержимое пластины и мыть колодцы три раза со свежим буфером мытья за стирку. После последней стирки инкубировать образцы с помощью стрептавидина рабочий раствор в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, а затем три моет, как попродемонстрировано.
После последней стирки обработать образцы субстратом теттраметилбензидина в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Когда цвет развивается, добавить стоп-решение из комплекта и прочитать оптической плотности поглощения в микроплюйте ELISA читателя. Для определения концентрации фактора некроза опухоли альфа, и интерлейкин-1 бета, используя иммуномагнитные мультиплексирования, этикетки стандарта, образца и управления трубами и вихрем магнитных флаконов шарика в течение 30 секунд.
Добавьте бисер в соответствующие колодцы многоплексной анализной пластины. Когда все шарики были добавлены, надежно вставьте портативную магнитную шайбу пластины, и ждать две минуты для бисера накапливаться на дне каждого хорошо, прежде чем быстро инвертирования как портативные магнитные пластины шайбу, и пластины сборки над мусорным контейнером. Затем добавьте 150 микролитров буфера для мытья к каждой хорошо и подождите 30 секунд, чтобы шарики накапливаться на дне.
Отбросьте содержимое снова, как только что продемонстрировано, и добавьте 25 микролитров универсального буфера анализа и 25 микролитров подготовленных стандартов, образцов и элементов управления. Печать пластины, по крайней мере 60 минут инкубации, защищены от света при комнатной температуре, и 500 вращений в минуту. В конце инкубации добавьте 150 микролитров буфера для мытья к каждой хорошо и дайте бисеру осесть в течение 30 секунд.
Затем используйте шайбу пластины, чтобы отказаться от содержимого колодец и маркировать каждый хорошо с 25 микролитров обнаружения антител смеси следуют две моет, как попродемонстрировано. После второй стирки инкубировать образцы с 25 микролитров стрептавидина PE в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце инкубации добавьте к каждому колодец 120 микролитров буфера чтения и запечатайте пластину на пятиминутную инкубацию, защищенную от света при комнатной температуре, на 500 вращений в минуту.
Затем загрузите пластину на мультиплексный анализ и отрегулируйте параметры чтения в соответствии с каждым анализом. Коронарная, венерическая и периферическая кровь были собраны у 52 пациентов, перенес которые прошли коронарную ангиографию и продемонстрировали высокую распространенность гипертонии и дислипидемии. Базовая коронарная концентрация большинства МПЦ была значительно ниже у пациентов, у которых развились серьезные неблагоприятные сердечно-сосудистые события, с большим снижением субпопуляций MPC CD34-положительных CD133-положительных и CD45-положительных, CD34-положительных, CD133-положительных, CD184-положительных.
Аналогичным образом, пациенты, у которых развились основные неблагоприятные сердечно-сосудистые события, имели повышенный базовый уровень коронарного количества растворимого ICAM-1 и меньшее количество белка металломатрикс 9. Коронарные ПДК и растворимые ICAM-1 продемонстрировали прогностические способности к основным неблагоприятным сердечно-сосудистым событиям, свободным от выживания. Интересно, что экспрессия фактора некроза опухоли альфа продемонстрировала вариации в зависимости от времени измерения и расположения коронарного отбора проб на основе сравнения различных областей люмена в одной и той же коронарной артерии с использованием внутрисосудистого ультразвука.
Во время изоляции MPC, не забудьте перенести кровь на градиент плотности, и собирать клетки из интерфейса после центрифугации тщательно. Периодическое вихревое покрытие предотвращает выпадение бисера, а использование шайбы магнитной пластины помогает держать бусинки внутри колодцев во время мытья. Коронарные МПЦ и растворимые молекулы полезны для стратификации риска сердечно-сосудистых событий во время последующей деятельности после ангиопластики, помогая в предоставлении вторичных профилактических средств лицам высокого риска, поскольку этот метод отражает патофизиологический процесс, который происходит во время прекращения растворения, это может быть полезно для условий, в которых сосудистая биология играет определенную роль.
